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(河南工业大学,河南郑州 450001)

醇溶蛋白是单体蛋白,分子量在2.8～5.5 kDa之间,通过分子内二硫键、氢键和疏水相互作用形成球状结构,无分子间二硫键[1-2]。根据醇溶蛋白低pH下A-PAGE电泳迁移率分为4组:α-、β-、γ-、ω-醇溶蛋白,其中ω-醇溶蛋白无半胱氨酸,半胱氨酸对面筋结构和功能有着重要的作用,α-、β-和γ-醇溶蛋白由于硫氨基酸含量较多,被称为富硫醇溶蛋白[2]。醇溶蛋白在面团形成过程中赋予面团以流动性和延展性,麦谷蛋白则与面团弹性、韧性和抗延展性有关,因此,良好的面团特性是要醇溶蛋白和麦谷蛋白共同作用,它们形成的具有延展性和粘弹性的面筋蛋白网络结构,存在巯基和二硫键的交换反应,在面制品中发挥网络骨架的作用[3-8]。虽然目前关于醇溶蛋白的研究较为丰富,但影响馒头品质的内在机理并不清楚,根据贾峰等[9-11]关于小麦粉蛋白质溶解性差异的韦恩分类研究,可将小麦蛋白质分成15个组分,从而可从更小的分子结构方面研究醇溶蛋白如何影响馒头面团特性。

本文选取根据韦恩分类研究提取出的五种醇溶蛋白亚组分(gli8、gli9、gli10、gli11、gli15),将其分别加到特一粉中,与未添加任何亚组分的对照组进行对照,分析其分别对馒头面团面筋指数、湿面筋含量、拉伸断裂力、拉伸距离、游离巯基含量的影响及在醒发过程中馒头坯的高和径的变化规律,从而为后续鉴定其性质提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

特一粉 河南金苑粮油有限公司;安琪高活性干酵母 安琪酵母股份有限公司;十二烷基硫酸钠(SDS)、75%乙醇、氯化钠、L-半胱氨酸、β-巯基乙醇、5，5′-二硫双(2-硝基苯甲酸)DTNB、三氯乙酸 均为分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司;透析袋MD34 北京索莱宝生物科技有限公司。

HM750海氏和面机 青岛汉尚有限公司;DH-YM600全自动连续压面机 鼎海精机大丰有限公司;OMJ-P32热风循环醒发箱 河北省欧美佳食品机械有限公;AY120电子分析天平 日本岛津制作所;HZT-A1000电子天平 福州华志科学仪器有限公司;TDL-60B飞鸽牌离心机 金坛市华锋仪器有限公司;722S可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司;JMCZ面筋指数测定仪 杭州天成光电有限公司;TA-XT2I质构分析仪 英国SMS公司;SLLDZ4-1500F商用不锈钢冷冻冷藏柜 上海金城制冷设备有限公司;FD-1A-50冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 醇溶蛋白亚组分的提取 根据张滨和贾峰等[9-10]关于小麦粉蛋白质溶解性差异的韦恩分类研究,按照液固比5∶1 (v/w)将特一粉用75%乙醇提取出醇溶蛋白,磁力搅拌1 h后乙醇在30 ℃下使用旋转蒸发器蒸发掉,40 ℃ 烘干12 h;按照液固比5∶1 (v/w)溶于蒸馏水,室温振荡1 h,在4 ℃ 3500 r/min离心30 min得到上清液1和沉淀1;将上清液1在40 ℃烘干12 h按照液固比5∶1 (v/w)溶于0.05 mol/L NaCl,室温振荡1 h,在4 ℃ 3500 r/min离心30 min,得到上清液2和沉淀2;将上清液2透析(温度25 ℃,3～4 h换一次蒸馏水)16 h后,在40 ℃烘干12 h,以液固比5∶1 (v/w)溶于1.5% SDS,将在4 ℃ 3500 r/min离心30 min,上清液再次在相同条件下透析、并烘干,得到醇溶蛋白亚组分(gli9),离心后的沉淀在40 ℃烘干12 h得到醇溶蛋白亚组分(gli13);将沉淀2以液固比5∶1 (v/w)溶于1.5% SDS,在4 ℃ 3500 r/min离心30 min,得上清液,将其透析16 h,40 ℃烘干12 h得到醇溶蛋白亚组分(gli8),离心后的沉淀在40 ℃,烘干12 h得到醇溶蛋白亚组分(gli12);将沉淀1以液固比5∶1 (v/w)溶于0.05 mol/L NaCl,在4 ℃ 3500 r/min离心30 min,得到上清液3和沉淀3;将上清液3透析16 h,40 ℃烘干12 h后按照液固比5∶1 (v/w)溶于1.5% SDS,4 ℃ 3500 r/min离心30 min,得到上清液和沉淀,将上清液透析16 h,40 ℃烘干12 h得到醇溶蛋白亚组分(gli10),沉淀40 ℃烘干12 h得到醇溶蛋白亚组分(gli14);沉淀3以液固比5∶1 (v/w)溶于1.5% SDS,将4 ℃ 3500 r/min离心30 min,得到的上清液透析16 h,40 ℃烘干12 h得到醇溶蛋白亚组分(gli11),离心后的沉淀40 ℃烘干12 h得到醇溶蛋白亚组分(gli15)。将所得八个亚组分通过SDS-PAGE电泳实验发现它们的分子量不同(实验结果待发表)。其中gli12、gli13、gli14的提取率极小,分别为0.0023%、0.0020%、0.0018%,很难进行实验,所以此三类亚组分暂不考虑。测出gli8、gli9、gli10、gli11、gli15的提取率分别为0.07%、0.07%、0.1%、2.4%、0.75%。

1.2.2 馒头面团的制作 依据醇溶蛋白亚组分(gli8、gli9、gli10、gli11、gli15)提取率,将这个五个亚组分分别按照提取率加到制作馒头面团所需的特一粉中,gli8、gli9、gli10、gli11、gli15添加量分别以特一粉的0.07%、0.07%、0.1%、2.4%、0.75%的比例添加,酵母0.8%,加水量45%,和面12 min。

1.2.3 湿面筋含量及面筋指数测定 湿面筋含量和面筋指数参考GB/T 5506.2-2008小麦和小麦粉面筋含量[12],仪器法测湿面筋稍作改动。取馒头面团14.5 g,用200 mL 20 g/L NaCl溶液洗涤,洗涤面筋至碘化钾滴定不变蓝,将洗好的面筋球挤压出水分至质量不再变化,称量洗涤出的面筋质量来计算湿面筋含量,见式(1)。

式(1)

称量好的面筋球放入面筋指数仪中离心120 s,离心结束后取出筛上物称量其质量,并计算面筋指数,见式(2)。两次试验求其平均值,结果保留两位小数。

式(2)

1.2.4 面团拉伸特性测定 采用质构仪参照拱姗姗[13]的方案测定面团拉伸特性,测定指标包括拉伸断裂力和拉伸距离。

醒发后面团的拉伸特性测定的样品制备:将馒头面团做成馒头坯后放入湿度85%、温度35 ℃醒发箱中醒发40 min后取样。

1.2.5 面团游离巯基含量的测定 参考郭兴风[14]快速测定游离巯基方法并稍作改动。绘制L-半胱氨酸标准曲线:用0.2 mol/L Tris-Gly缓冲溶液将L-半胱氨酸配制成不同浓度(0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08 mmol/L)的标准溶液,测定其在412 nm处的吸光度。以吸光度为横坐标,L-半胱氨酸浓度为纵坐标,得到标准曲线为:y=0.2239x-0.0088,R2=0.9983。

取一定量未醒发面团样品于-45 ℃ 1.0 Pa冷冻干燥12 h,加入10 mL 0.2 mol/L Tris-Gly缓冲溶液使样品混匀,4 ℃ 3500 r/min离心10 min;取4 mL上清液,加入10 mmol/L的DTNB溶液0.1 mL,混合均匀,显色20 min,在波长412 nm处测定吸光度;通过L-半胱氨酸标准曲线计算出样品中的游离巯基的含量。

式(3)

其中:A:样品吸光度对应的L-半胱氨酸浓度,μmol/mL;C:称取的样品重量,g;10:溶解样品所用的0.2 mol/L Tris-Gly缓冲溶液的体积(mL)。

1.2.6 醒发过程中馒头坯高及径的测定 将1.2.2条件下的面团压片15次后取出100 g，搓成相同高径的圆形馒头坯,放入湿度85%、温度35 ℃的醒发箱中醒发,分别在醒发0、20、30、40 min时用直尺测定其高和径的大小。

1.3 数据分析

运用SPSS 20.0和Origin 8.5软件对实验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 醇溶蛋白亚组分对馒头面团面筋指数及湿面筋的影响

面筋指数表示面筋质量,面筋指数越大表示面筋筋力越强,反之面筋指数越小表示面筋筋力越弱。湿面筋含量反映面团中醇溶蛋白与麦谷蛋白通过氢键、疏水作用等非共价键和二硫键等共价键形成的面筋的多少。

如图1,添加gli8、gli9、gli10、gli11、gli15的馒头面团面筋指数与对照组相比均降低,可能是吴伟都等[15]研究发现醇溶蛋白决定着面团的面筋指数,而湿面筋与其无关,外源添加破坏了醇溶蛋白和麦谷蛋白的比例,使得面筋的质量变差。添加gli8的面筋指数与对照组相比无显著性差异(p>0.05),而gli9、gli10、gli11、gli15与对照组相比显著降低(p<0.05)。醇溶蛋白影响面筋指数主要与gli9、gli10、gli11、gli15有关。其中gli11的面筋指数最小,为10.15%,是特一粉的52.12%,这可能是因为其添加量大或在特一粉醇溶蛋白中占的分量大,对醇溶蛋白的性质起着极大的作用。添加gli15的湿面筋含量与对照组相比无显著性影响(p>0.05),这与醇溶蛋白与湿面筋无关的结果一致;添加gli11的湿面筋含量显著高于对照组(p<0.05),添加gli8、gli9和gli10的湿面筋含量比对照组低。实验结果表明,不同的醇溶蛋白亚组分对湿面筋的影响与前人关于醇溶蛋白对湿面筋的影响并不一致。

图1 醇溶蛋白亚组分对馒头面团面筋指数和湿面筋含量的影响Fig.1 Effect of gliadin subcomponent on the gluten index and wet gluten content of steamed bread dough注:A:对照组(未添加任何醇溶蛋白亚组分);B:gli8-0.07%;C:gli9-0.07%;D:gli10-0.1%;E:gli11-2.4%;F:gli15-0.75%。柱上标注的不同小写字母表示数值p<0.05,存在显著性差异,图2～图4同。

2.2 醇溶蛋白亚组分对馒头面团质构拉伸的影响

2.2.1 醇溶蛋白亚组分对未醒发馒头面团质构拉伸的影响 由图2可知,添加gli8、gli9、gli10和gli11的馒头面团拉伸断裂力与对照组的相比,都有明显的增大,其中添加gli8的馒头面团的拉伸断裂力是127.92 g,且是对照组的1.52倍,而gli9、gli10和gli11组分之间没有显著性差异(p>0.05);而与对照组相比,添加gli15后拉伸断裂力和拉伸距离都不具有显著性差异(p<0.05),说明在面团未醒发时gli15对面团的拉伸断裂力和拉伸距离的影响小。

图2 醇溶蛋白亚组分对馒头面团质构拉伸的影响Fig.2 Effect of gliadin subcomponent on the extensograph properties of steamed bread dough

有研究表明[12]醇溶蛋白赋予面团延伸性,延伸性是将其拉到某种长度而不致断裂的特性,可用拉伸至断裂时的最大长度进行表示,即拉伸距离。添加gli8、gli9和gli10的拉伸距离与对照组相比都有明显减小,其中添加gli8的相差最大为18.37 mm,是对照组的76.89%,说明在面团形成时,gli8、gli9和gli10对面团的面筋网络结构有着明显的影响;而gli11和gli15与对照组相比没有显著性差异(p>0.05),这与醇溶蛋白赋予面团延伸性结果不一致,可能是因为将醇溶蛋白按照溶解性分成亚组分时,因为其溶解性的不同,影响了面粉本身的醇溶蛋白及蛋白质的性质,特别是麦谷蛋白。

2.2.2 醇溶蛋白亚组分对醒发后馒头面团质构拉伸的影响 由图3可见,添加gli8、gli9、gli10和gli11的拉伸断裂力与对照组相比,都有明显增大,这与醒发之前的结果大致相同;面团醒发之前添加gli8的拉伸断裂力大于添加gli11的,而醒发后添加gli11的比gli8的大,可能gli11对形成面筋的作用是在醒发阶段;添加gli15的面团虽然拉伸断裂力与对照组不具有显著性差异(p>0.05),但是拉伸距离显著大于对照组(p<0.05),可能是添加的gli15在面团醒发阶段对面筋网络的形成有一定的影响。面团醒发后gli11和gli15赋予了面团延伸性,从而使面团的拉伸距离增大。添加gli8、gli9和gli10的拉伸距离依然比对照组的小,但是添加gli8的拉伸距离与对照组有显著性差异(p<0.05);而添加gli9和gli10的无显著性差异(p>0.05);添加gli11的拉伸距离比对照组的大,且有着显著性差异(p<0.05);这些与醒发之前都有所差别。在醒发过程中gli8、gli9、gli10和 gli11对面筋网络结构存在一定的影响。

图3 醇溶蛋白亚组分对醒发后馒头面团质构拉伸的影响Fig.3 Effect of gliadin subcomponent on the extensograph properties of steamed bread dough after proofing

2.3 醇溶蛋白对馒头面团游离巯基的影响

有研究表明在面团形成过程中发生游离巯基到二硫键的交换反应[16],且谷蛋白/醇溶蛋白的比例升高,更容易使游离巯基氧化成二硫键[17],从图4可得出,添加gli8、gli9、gli10、gli11和gli15的馒头面团的游离巯基含量与对照组相比都有所增加,其中添加gli10的游离巯基含量最高,为2.48 μmol/g,是对照组的1.17倍,可能是由于这几个组分含有半胱氨酸残基,从而使测得游离巯基含量都增加。添加gli11的与对照组之间没有显著性差异,可能是gli11没有或者只有极少量的半胱氨酸残基。

图4 醇溶蛋白亚组分对馒头面团游离巯基的影响Fig.4 Effect of gliadin subcomponent on the free SH of steamed bread dough

2.4 醇溶蛋白对馒头面团醒发过程中高及径的影响

如表1,在醒发过程中对照组的高和径都有所增加,只是高开始变化的时间点是醒发30 min时,而径在醒发20 min时就有所增加。添加gli8的馒头坯高的变化主要集中在醒发的前30 min,而其径的变化却在醒发的后20 min,且与对照组比较,添加的gli8使馒头坯在醒发过程中径呈现减小的趋势,推测是gli8对馒头结构的横向结构有所影响。添加gli9和gli10的馒头坯在醒发过程中高度一直在减小,其径在增加,与对照组相比,gli9和gli10可能改变了面筋结构的纵向结构。添加gli11的馒头坯高度几乎没怎么变化,而其径有大幅度的增大,可能添加的gli11严重影响了整个馒头坯面筋网络的形成。在醒发过程中,添加gli15的馒头坯高度在一直增加,而其径却几乎没变化,与添加gli11的相反。说明不同的组分在馒头结构形成的过程中起着不同的作用。

表1 醇溶蛋白亚组分对馒头坯醒发过程中高和径的变化规律的影响Table 1 Effect of gliadin subcomponent on the change of height and diameter during the proofing of steamed bread dough

3 结论

gli11和gli15对面筋质量起着决定性作用;gli11虽然会使湿面筋含量增加,但面筋结构并不稳定。在面团形成过程中gli15对面团拉伸断裂力影响不大;gli11和gli15在醒发过程阶段赋予面团延伸性。gli8、gli9、gli10、gli11和gli15都使馒头面团的游离巯基含量有所增大。在醒发过程中,gli8和gli15对馒头结构的横向结构有一定的影响;gli9和gli10使得馒头坯变塌;gli11对馒头坯的纵向结构有着影响。由此看出这五种亚组分对馒头面团的面筋指数、湿面筋含量、拉伸特性、游离巯基含量以及在醒发过程中高和径的变化的影响有所不同,其亚组分表现出来的性质并不一定与醇溶蛋白保持一致,这可能是外源添加的醇溶蛋白亚组分影响了醇溶蛋白各组分比例。