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(1.陕西理工大学生物科学与工程学院,陕西省天麻山茱萸工程技术研究中心,陕西理工大学中德天然产物研究所,陕西汉中 723000;2.陕西百圣生物工程有限公司,陕西汉中 724300)

天麻(GastrodiaelataBl.)又名赤箭、定风草、水洋芋等,为兰科天麻属多年生草本植物,是一种名贵的中药材,属国家三级保护物种,药用部位为其块茎[1],其性平、味甘,具有息风止痉、祛风通络、平抑肝阳等功效,用于治疗头痛眩晕、小儿惊风、癫痫、抽搐、肢体麻木、破伤风等病症[2]。此外,天麻还可作为食品原料,可用以加工天麻酒、天麻面、天麻糕点、天麻片、天麻丝、天麻糖、天麻茶等[3]。

天麻中含有天麻素、天麻苷元、天麻多糖、蛋白质、氨基酸以及铬、锰、铁、锡等微量元素等多种成分[4-5],其中最主要的活性成分是天麻素,天麻素易溶于水、甲醇和乙醇。目前天麻的功能及药理活性研究中均以醇提物为主,但醇提法相比较水提法成本高,易污染环境[6-7]。水作为强极性溶剂,水提法具有安全、成本低廉的特点。目前有关天麻水提物的相关研究较少,王亚男等[8]对天麻水提取物开展了研究,分离鉴定了天麻水提物中23个化合物的化学结构,而有关天麻水提物的主要营养和活性成分及抗氧化活性的研究尚未见报道。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

天麻 陕西省汉中市略阳县,经陕西理工大学生物科学与工程学院王勇博士鉴定；DPPH 日本东京化成工业株式会社;没食子酸 北京索莱宝科技有限公司;芦丁 国药集团;天麻素、对羟基苯甲醇、葡萄糖 中国食品药品检定研究院;福林-酚试剂 合肥华耐施生物公司;乙腈、磷酸 天津市科密欧化学试剂有限公司;单体酚 上海诗丹德生物技术有限公司。

RV10型旋转蒸发仪 德国IKA公司;4802S紫外分光光度计 龙尼柯上海仪器有限公司;Alpha1-2型冷冻干燥机 德国Christ;Rotina 420R台式离心机 德国Hettich;722G可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司;Allegra 64R型离心机 美国贝克曼库尔特公司;KND-B凯氏定氮仪 上海新嘉电子有限公司;U-3000高效液相色谱仪 Thermo公司;电感藕合等离子质谱(ICP-MS) 美国Thermo Fisher Scientific公司;WX-8000微波消解仪 上海屹尧仪器科技发展有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理及提取物制备 天麻炮制处理参考本团队已建立的方法[9]。干天麻粉,按料液比1∶37 g/mL加蒸馏水,热回流提取90 min,重复提取2次,合并3次滤液,滤液冷却至室温,4 ℃,10000 r/min离心10 min,活性炭脱色,45 ℃减压浓缩,冷冻干燥24 h得天麻水提物干粉。

1.2.2 天麻水提取物的常规理化和营养成分含量测定 根据国家标准中规定的方法测定天麻的水分[10]、灰分[11]、淀粉[12]、脂肪[13]含量。采用凯氏定氮法测定[14]蛋白质含量,差减法[15]测定碳水化合物含量。

1.2.3 矿物质含量测定 采用电感耦合等离子发射光谱法(ICP-MS)测定[16]矿物质元素含量。

1.2.4 氨基酸组成及含量测定 采用蛋白水解液氨基酸分析系统测定氨基酸含量,参照徐顶巧等[17]方法。

1.2.5 天麻水提物中总多酚、总黄酮和原花青素含量测定 采用Folin-Ciocalteu比色法[18]测定总多酚含量,横坐标为没食子酸质量浓度(mg/mL),纵坐标为吸光度,标准曲线回归方程y=0.0628x+0.0684,R2=0.9990。采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法[19]测定总黄酮含量,横坐标为芦丁质量浓度(mg/mL),纵坐标为吸光度,标准曲线回归方程y=0.0027x+0.0007,R2=0.9995。采用香草醛-盐酸法[20]测定原花青素的含量,横坐标为香草醛质量浓度(mg/mL),纵坐标为平均吸光度,标准曲线回归方程y=24.97x+0.008(R2=0.9990)。

1.2.6 天麻素和对羟基苯甲醇含量测定 天麻素和对羟基苯甲醇含量测定参考中国药典2015版的方法进行测定[21]。色谱条件:色谱柱:Inertsil/WondaSil C18(250 mm×4.6 mm,4 μm),流动相:乙腈(A),0.05%的磷酸(B),A∶B=3∶97,流速:1 mL/min,检测波长:220 nm,进样量:10 μL,检测温度:25 ℃,HPLC的总运行时间为20 min。

1.2.7 多酚组成分析 色谱条件[22]:色谱柱:Inertsil/WondaSil C18(250 mm×4.6 mm,4 μm),流动相乙腈(A)和质量分数0.2% 的冰乙酸,检测波长280 nm和254 nm,流速0.8 mL/min,进样量10 μL,检测温度25 ℃,HPLC的总运行时间为45 min。

梯度洗脱条件:0～15 min,5%～6% A;15～30 min,6%～30% A;30～35 min,30%～45% A;35～45 min,45%～65% A。

1.2.8 抗氧化活性测定

1.2.8.1 铁还原力(ferric reducing antioxidant potential assay,FRAP)测定 铁还原力测定采用旷慧等[23]方法进行。

1.2.8.2 清除DPPH·能力测定 清除DPPH·能力测定采用李鑫鑫等[24]方法。取浓度为2、4、6、8、10 mg/mL的样液各10 μL，在避光条件下加入140 μL的DPPH储备溶液(无水乙醇溶解，400 μg/mL)，混匀，避光反应30 min，之后在515 nm处检测其吸光度，VC作为阳性对照。结果用DPPH自由基的清除率表示，计算公式为：

DPPH·清除率(%)=(1-(A1-A2)/A0)×100

式(1)

式中：A1为样品的吸光度；A2为样品的背景值；A0为空白对照组的吸光度值。

1.2.8.3 清除OH·的能力测定 取浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL的样液各0.5 mL,分别加入6 mmol/L硫酸亚铁和6 mmol/L水杨酸各0.5 mL,充分振荡摇匀,静置10 min后加入0.5 mL H2O2,室温下反应35 min,8000 r/min离心10 min,510 nm下检测其吸光度,VC为阳性对照。根据式(2)计算OH·清除率。

式(2)

式中:A1为样品的吸光度;A2为背景的吸光度;A0为空白的吸光度。

式(3)

式中：A1为样品的吸光度；A2为背景组的吸光度；A0为空白的吸光度。

1.3 数据处理

每个实验3次重复,数据以平均数±标准偏差显示,数据采用Excel、SPSS软件进行分析处理并作图。

2 结果与分析

2.1 天麻水提取物的常规理化和营养成分含量

对天麻水提物中的水分、灰分、淀粉、粗蛋白、粗脂肪、总多糖、碳水化合物常规营养成分的含量进行了测定,结果见表1。天麻水提物中蛋白质的含量为9.21 g/100 g,碳水化合物含量高达79.80 g/100 g,脂肪含量仅4.01 g/100 g,符合现代人追求低脂饮食的需求。天麻水提取物中碳水化合物、蛋白质、脂肪等人体必需的七大类营养物质为93 g/100 g,因此天麻水提物具有高营养、低脂肪的特点,具有很好的开发价值。康明等[25]测定了德江天麻中的灰分含量为2.55 g/100 g,灰分含量高于本研究结果。葛进等[26]比较了不同产地的天麻营养成分含量,多糖含量为11.83%～24.46%,粗脂肪为1.09%～2.09%,淀粉10.29%～21.84%,粗蛋白为2.15%～9.27%,与本研究结果相比，其多糖含量和淀粉含量较低。多糖和淀粉在热水中溶解度较大,而本研究的提取工艺是通过热水回流提取3次,天麻块茎中的多糖和淀粉被充分溶解而提取出来,故本研究的天麻水提物中多糖含量和淀粉含量均比葛进等的研究结果高。

表1 天麻水提取物中营养成分Table 1 Nutrient contents of the aqueous extract of Gastrodia elata

2.2 矿物质含量

通过ICP-MS测得10种矿物质含量的结果见表2,由表2可知，天麻中含有丰富的矿物质元素,其中常量元素中钾元素含量最高,为25477.45 mg/kg,这与李金玲等[27]的研究一致,钾元素含量最高为25530 mg/kg。其次钙含量高达2224.71 mg/kg可加工成高钙食品,用于补充人体所需要的钙。本研究结果K/Na值为49.90,高钾低钠的营养结构对高血压、高血脂症患者特别有益[28]。锌在人体生长发育、免疫、内分泌、生殖遗传等重要生理过程中起着极其重要的作用,天麻中锌含量丰富,为45.33 mg/kg;铁和锰的含量分别为45.10、21.54 mg/kg,这些矿物质元素对机体的造血细胞、免疫系统和中枢神经有非常重要的作用。此外,硒是人体必需的微量元素之一,人体缺硒可患克山病、大骨节病、心脏病、白内障、新生儿溶血性贫血等疾病,但过量的硒可引起硒中毒。天麻水提物中含有少量的硒元素(0.10 mg/kg),郎春燕报道野生天麻中硒元素为1.77 mg/kg,其结果高于本研究结果[29]。2018年4月开始执行的《中国居民膳食营养素参考摄入量》[30]中规定18岁以上者的推荐摄入量为60 μg/d,天麻的成人每天推荐使用量为10～30 g,由此可摄入硒元素。

表2 天麻水提取物中矿物质元素含量Table 2 Contents of mineral elements of the aqueous extract from Gastrodia elata

2.3 氨基酸组成及含量

氨基酸是构建生物机体的众多生物活性大分子之一,是构建细胞、修复组织的基础材料。天麻水提物中氨基酸种类及含量丰富(见表3),其中总氨基酸(TAA)的含量为29.090 mg/g,必需氨基酸(EAA)占总氨基酸含量的16.85%。必需氨基酸中缬氨酸的含量最高为0.86 mg/g,其次是苏氨酸,含量为0.69 mg/g,酪氨酸含量最低,为0.23 mg/g。非必需氨基酸(NEAA)占总氨基酸含量的83.15%,为24.470 mg/g,天冬氨酸含量最高,达7.47 mg/g,精氨酸含量最低,为0.88 mg/g。非必需氨基酸的摄取,对动物与人类的健康、成长、发育、繁殖十分重要。与山药相比,发现山药中必需氨基酸中缬氨酸的含量最高,为0.617 mg/g,非必需氨基酸占总氨基酸含量的70.82%。天麻中总氨基酸含量高于淮山药,氨基酸种类也多于淮山药,可为天麻的开发利用提供理论依据。

表3 天麻水提取物中氨基酸的组成和含量(mg/g)Table 3 Composition and content of amino acids in Gastrodia elata water extract(mg/g)

2.4 天麻水提物中总多酚、总黄酮和原花青素含量

由表4可知,天麻水提物中总多酚为17.0 mg/g,总黄酮为9.0 mg/g,原花青素含量为3.3 mg/g(见表4)。孟月丽等[31]检测了铁棍山药皮中的总多酚,含量为3.578 mg/g;郑朝华等[32]测定了西洋参中的总黄酮,含量为1.756 mg/g;紫山药中的原花青素,含量为2.10 mg/g,天麻水提取物中总多酚、总黄酮和原青花素均高于铁棍山药皮总多酚、西洋参总黄酮和紫山药原花青素,可为天麻作为药物的研发奠定一定的基础。

表4 天麻水提取物中总多酚、总黄酮和原花青素含量Table 4 Contents of total polyphenols,total flavonoids and procyanidins in Gastrodia elata water extract

2.5 天麻素和对羟基苯甲醇

通过计算峰面积与样品质量之间的关系,得到天麻素和对羟基苯甲醇对照品的回归方程(见表5)。中国药典(2015版)中规定天麻药材中天麻素和对羟基苯甲醇的含量大于0.25%,根据回归方程(表5)测得的天麻水提取物中天麻素和对羟基苯甲醇的总含量为3.51%,符合中国药典的规定,且总含量较高。天麻中的主要药理活性成分为天麻素,天麻素易溶于水,本研究中采取热水回流提取能较好地提取到天麻中的天麻素,该提取物具有药理活性成分高的特点,可作为添加剂应用在保健食品中。

表5 天麻素和对羟基苯甲醇含量测定Table 5 Determination of gastrodin and p-hydroxybenzyl alcohol

图1 UPLC测定天麻素和对羟基苯甲醇色谱图Fig.1 UPLC chromatographic profiles ofgastrodin and hydroxybenzyl alcohol注:(A)对照品图;(B)天麻水提物；峰1:天麻素;峰2:对羟基苯甲醇。

2.6 多酚组成

利用UPLC测定了14种单体酚,天麻水提物中检测到了7种多酚(不包括前面已经检测到的天麻素和对羟基苯甲醇),分别为荭草素、槲皮素、咖啡酸、表儿茶素、儿茶素、肉桂酸、对羟基苯甲酸,其中荭草素含量最高,达161.96 mg/100 g,对羟基苯甲酸最低是(0.70±0.02) mg/100 g,总酚含量为0.291 mg/g,与前面检测到的总多酚含量相差甚远,可能是天麻中还含有其他种类多酚且含量甚高,其他多酚种类及含量还有待进一步研究。

2.7 天麻水提物的抗氧化活性

图2 天麻水提物的抗氧化性Fig.2 Antioxidation of aqueous extract from Gastrodia elata注:.(A)天麻水提物的总还原力;(B)天麻水提物的DPPH·清除能力;(C)天麻水提物的OH·清除能力;(D)天麻水提物的清除能力。

表6 天麻水提取物中多酚组成(mg/100 g干物质)Table 6 Polyphenol composition in Gastrodia elatawater extract(mg/100 g·extract dry weight)

3 结论

本研究检测了天麻水提物中的营养物质和活性成分,并且评价了其抗氧化活性。天麻中水分、灰分、淀粉、粗蛋白、粗脂肪、总多糖和碳水化合物的含量分别是4.60、1.55、40.30、9.21、4.01、38.24、79.80 g/100 g,矿物质中钾元素的含量最高,为25477.45 mg/kg;天麻中活性成分总多酚、总黄酮和原青花素分别为17.0 mg/g、9.0 mg/100 g、3.3 mg/g,天麻素和对羟基苯甲醇的含量为2.87%和0.64%;天麻中含有种类丰富的多酚,本研究中检测到7种多酚,为对羟基苯甲酸、儿茶素、咖啡酸、表儿茶素、荭草素、槲皮素和肉桂酸,其中荭草素的含量最高,为161.96 mg/100 g。随着天麻提取物浓度的增加,其还原力和对自由基的清除能力均逐渐增强,当天麻水提物浓度为10 mg/mL时,对DPPH·清除率可达90%,接近于阳性对照VC。由此可见,天麻水提物不仅具有较高的营养价值,而且具有一定的抗氧化活性,在未来一定会有很好的开发和应用前景。