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(1.广东环凯微生物科技有限公司,广东广州 510663;2.广东省微生物研究所,广东广州 510070)

副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)为益生菌中乳杆菌属的干酪乳杆菌,有良好的耐酸及胆汁抗性,具有能调节肠道生态平衡、增强免疫力、抗肿瘤、降胆固醇、降血压和预防糖尿病发生等生理功能[1],以其为原料开发功能食品具有明确的保健意义。但益生菌在生长过程中,不形成芽孢,抗性较差,贮存稳定性差,其保健功效损失快。为提高加工和储存过程中的稳定性,确保最多的活菌数达到肠道才释放,从而发挥益生菌的最大功能活性,将益生菌经微胶囊技术包埋是有效的方法之一。

微胶囊化技术是采用天然或合成的高分子材料为囊材,通过化学、物理或物理化学法将活性物质即囊芯包裹起来形成半透性或密封性囊膜的微型胶囊[2]。然而一些研究表明[3],微囊化对益生菌在胃液中的存活并没有显现出较好的保护效果。因此研究者们主要通过3种手段提高微囊对活菌的保护效果:第一种是通过在微囊表面进行包衣[4];第二种是使用多种壁材复配[5-6];第三种是在壁材中加入益生元,提高益生菌对不利生长环境的适应性,从而提高其存活率[7]。制得的微胶囊主要有储集型、基质型和涂层基质型三种类型。其中芯材被壁材膜完全包被的为储集型微胶囊,芯材被分散在壁材内部和表面的为基质型微胶囊,涂层基质型微胶囊则是前两者的结合[8]。其中,双层包埋制得的涂层基质型微囊较多。

本试验中研究的乳酸菌R8,为本试验室经过抗性筛选、驯化选育的优良菌种,并鉴定为副干酪乳杆菌[9]。目前该菌种经高密培养的发酵工艺研究、放大工艺优化,可实现250 L规模的发酵生产[10]。为进一步提高R8的稳定性,并实现在肠道定向释放的目的,本试验采用多种手段增强微囊对益生菌的保护作用,拟将蛋白质和海藻酸钠复配为首层包埋壁材,然后在固定液中用壳聚糖覆膜,制备双层包埋的涂层基质型微囊微胶囊,使在益生菌周围形成致密的物理屏障。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

副干酪乳杆菌R8 广东省微生物研究所筛选驯化提供[9];MRS培养基(g/L):葡萄糖20.0 g,胰蛋白胨10.0 g,牛肉膏8.0 g,酵母粉4.0 g,Tween80 1.0 mL,K2HPO42.0 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,MnSO4·4H2O 0.05 g,柠檬酸铵2.0 g,CH3COONa·3H2O 5.0 g,蒸馏水1000 mL,pH6.2;乳糖、海藻酸钠、壳聚糖 食品级,广东大地食用化工有限公司;脱脂乳粉 食品级,广州硕维食品技术有限公司;豆粉 食品级,深圳市圣菂科技有限公司;香蕉、鸡蛋 市售;氯化钙 食品级,郑州瑞普生物工程有限公司;低聚半乳糖(95S)、低聚果糖(90S) 量子高科(中国)生物股份有限公司;菊粉 山东保龄宝生物技术有限公司。

Avanti J-20XP离心机 美国贝克曼库尔特公司;YC-015实验型喷雾干燥机 上海雅程仪器设备有限公司;LGJ-1冷冻干燥机 上海医用分析仪器厂;UV-1800全波长扫描分光光度计 日本岛津公司;HZQ-F100振荡培养箱 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 冻干保护剂种类的筛选 根据前期预实验,所筛选的乳酸菌冻干保护剂有10%乳糖、10%脱脂乳粉、10%豆粉、20%香蕉、20%全蛋水溶液。

副干酪乳杆菌R8经活化、发酵培养[11]后,经离心(8000 r/min,4 ℃离心10 min)收集的菌泥(干重计活菌数1.83×1011cfu/g)分别加入上述冻干保护剂的水溶液中,空白组以蒸馏水代替保护剂,菌泥终浓度为5%,充分混匀后将菌泥平铺在培养皿中,在超低温冰箱中-20 ℃预冻5～6 h后进行真空冷冻干燥,根据菌泥含水量估算干燥时间,主干燥阶段-30 ℃;终干燥阶段-40 ℃,最终菌粉水分<5%。冻干后测定用稀释平板计数法[12]检测活菌数,根据公式(1)计算得存活率,考察冻干保护剂对菌体冻干存活率的影响[13]。

式(1)

1.2.2 冻干保护剂对菌体储藏稳定性的影响 将添加不同保护剂冷冻干燥后的菌粉,分别在室温放置4个月,在4 ℃和-20 ℃放置1年,每月检测菌粉的活菌数,从而考察不同冻干保护剂对菌体储藏稳定性的影响。

1.2.3 益生元的筛选 以MRS培养基作为对照,试验组分别用2%低聚半乳糖、2%低聚果糖和2%菊粉替代MRS培养基中的葡萄糖,其他成分不变。将活化后的菌液以2%(V/V)接种量接入各培养基,37 ℃静置恒温发酵10 h后检测发酵液中的活菌数,确定出最适益生元[14]。

1.2.4 微胶囊的制备

1.2.4.1 制备乳化液 无菌操作条件下,准确称取菊粉和全蛋液,加水混匀,使菊粉终浓度为2%,全蛋液终浓度为20%;再加入5%菌泥搅拌均匀;后加入不同浓度(终浓度0.3%、0.5%、1%、1.5%)的海藻酸钠溶液继续搅拌,至形成均匀乳化液[8,15]。

1.2.4.2 固化 用喷雾干燥机在压力0.2～0.3 MPa,流速30 mL/min(水)的条件下将乳化液喷入含有不同浓度CaCl2(终浓度1%、2%、2.5%)和0.5%壳聚糖乙酸溶液中,固化30 min,形成微胶囊[8,15]。

1.2.4.3 干燥 固化处理后,8000 r/min离心10 min,立即进行冷冻干燥,即得成品。其中冷冻干燥时,先-20 ℃预冻5 h,主干燥阶段-30 ℃;终干燥阶段-40 ℃,最终菌粉水分<5%[8,15]。

1.2.4.4 微胶囊包封率的测定 1%海藻酸钠与全蛋液制备乳化液后,再于2.5%氯化钙溶液中固化,通过考马斯亮蓝比色法[16]测定固化液中剩余蛋白的含量,根据公式(2)计算得包封率,筛选出最优包埋组合[15]。

包封率(%)=(总乳蛋白OD值-上清液中乳蛋白OD值)/总蛋白OD值

式(2)

1.2.5 微胶囊释放特性的测定

1.2.5.1 人工模拟液的制备 人工胃液:盐酸16.4 mL,胃蛋白酶10 g,加水搅匀后定容至1000 mL,pH=1.5。

人工肠液:磷酸二氢钾6.8 g,加水500 mL溶解,用0.4%的氢氧化钠溶液调节pH至6.8,另取胰酶10 g加水适量使其溶解,将两液混合后,加水定容至1000 mL。

1.2.5.2 微胶囊在人工模拟液的耐酸性试验和肠溶性试验 耐酸性试验:称1 g微胶囊加入装有100 mL人工胃液的三角瓶中,于摇床中以(37±1) ℃、150 r/min处理,0、0.5、1.0、1.5、2、2.5 h取样用分光光度计测定600 nm波长下的OD值,测其透光率,根据透光率变化分析人工胃液中微胶囊的溶出情况[17]。

透光率=(人工胃液实时OD值-人工胃液初始OD值)/人工胃液初始OD值

肠溶性试验:称1 g微胶囊加入装有100 mL人工肠液的三角瓶中于摇床中以(37±1) ℃、150 r/min崩解。分别于 15、30、45、60 min取样用分光光度计测定600 nm波长下的OD值,根据透光率的变化分析人工肠液中微胶囊的溶出情况。于试验终点测定模拟肠液中的活菌数[17]。

1.3 数据处理

所有数据采用SPSS 13.0进行方差分析,结果均以均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用t检验,以p<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 冻干保护剂种类的筛选

菌体冷冻干燥后其活力变化的结果如图1所示:菌体不加冻干保护剂直接冻干后存活率仅为12.7%,说明冷冻干燥过程对菌体活力的影响较大;而不同保护剂对菌体均有极显著的保护作用(p<0.01),其作用大小排序为:20%全蛋液>10%脱脂奶粉>10%豆粉>10%乳糖>20%香蕉,其中添加20%全蛋液后的冻干存活率是无保护剂时的5倍。

图1 不同冻干保护剂对菌体冻干后活力的影响Fig.1 Effects of different freeze-dried protective agentson the viability of mycelia after freeze 注:**代表与空白对照组数据之间差异极显著(p<0.01)。

2.2 冻干保护剂对冻干菌粉储藏稳定性的影响

在应用双层包埋技术以提高益生菌数量和质量的稳定性时,是在益生菌表面先包覆蛋白质,然后再包一层特殊胶体[4],可见,蛋白质除了为冻干保护剂外,还考虑用作微囊的壁材,因此,进一步考察富含蛋白质的脱脂奶粉、豆粉和全蛋液作为冻干保护制备菌体冻干粉后的储藏稳定性。试验结果见图2。

添加不同保护剂后制得的冻干菌粉,在室温条件贮存,活菌数逐月下降,且第1个月下降速率较快,然后逐渐趋缓,贮存3个月时添加不同保护剂的菌体活菌数均已降至106cfu/g,4个月后各菌粉活菌数均已降至103cfu/g以下,于观察终点,以20%全蛋液为保护剂制得的冻干菌粉活菌数最多。

添加不同保护剂后制得的冻干菌粉在4 ℃贮存1年的过程中,前6个月活菌数均较稳定,从第7个月开始有逐月下降的趋势;其中,全蛋液为保护剂时,活菌数下降速率比另外两种保护剂制得的菌粉活菌数下降更快,但得益于其起始活菌数高于后两者,储存1年后,其活菌数仍最多。

添加不同保护剂后制得的冻干菌粉,在-20 ℃条件下贮存较稳定,贮存1年后活菌数均维持在1010cfu/g以上。同时试验结果也表明,以全蛋液为保护剂制得的冻干菌粉,储存1年后的活菌数均较10%脱脂奶粉和10%豆粉为保护剂制得的冻干菌粉多。

综上所述,以20%全蛋液为冻干保护剂制得的冻干菌粉冻干存活率最高,且置不同温度的储存条件下,于考察时间终点其菌粉活菌数均为最高,因此选取20%全蛋液为最佳冻干保护剂。

2.3 益生元的筛选

用不同的益生元代替培养基中的葡萄糖后,均能作为碳源被菌体所利用,其中2%菊粉效果最好,发酵后活菌数略高于原培养基,但无统计学差异,结果详见图3。因此,考虑将菊粉添加至微胶囊包埋的乳化液中,以促进活菌释放后的生长。

图3 添加不同益生元对菌株的生长促进作用Fig.3 Growth promoting effects of different prebiotics on 注:**:与2%葡萄糖组相比差异极显著,p<0.01。

2.4 微胶囊包材对包封率的影响

制得的微胶囊包封率检测结果如图4所示:海藻酸钠在0.3%～1%浓度范围内的相同浓度下,随着氯化钙浓度的升高,包封率逐渐增大;当海藻酸钠浓度达1.5%时,随着氯化钙的浓度升高,包封率反而下降;这可能跟溶液粘稠度有关,海藻酸钠浓度越高,溶液越粘稠,越不利于与氯化钙的充分接触,难以形成均一的保护层。

图4 菌体微胶囊包封率的测定Fig.4 Determination of encapsulation

当海藻酸钠浓度为1.5%,氯化钙浓度为1%时,微胶囊包埋率最高,达78.09%;当海藻酸钠浓度为1%,氯化钙浓度为2.5%时,微胶囊亦具有良好的包埋作用,包埋率达77.60%;将两者数据进行t检验,不具统计学差异。综合考虑包埋液添加菌泥后的浓稠度,最终选取海藻酸钠浓度为1%,氯化钙浓度为2.5%为最优包埋组合。

2.5 微胶囊特性的测定

2.5.1 微胶囊耐酸性试验结果 由图5可看出微胶囊在人工胃液中透光率的变化情况:微囊与人工胃液接触0.5 h后,透光率显著下降(p<0.05),1 h后则趋势变缓,随后各时间点抽样检测结果与1 h比较,无显著差异(p>0.05),整个处理过程透光率变化幅度不大,约5%。因此可以证明益生菌微胶囊能够耐受胃液的破坏[18]。

图5 微胶囊的耐酸性Fig.5 Acid resistance of microcapsules注:*:与0 h相比差异显著,p<0.05;**:与0 h相比差异极显著,p<0.01。

2.5.2 微胶囊肠溶性试验结果 由图6可知,微囊与模拟肠液接触45 min后透光率基本保持不变,且45 min和60 min后透光率无统计学差异,表明微胶囊中的益生菌在模拟肠液中45 min内释放完毕[18]。于试验终点测定模拟肠液中的活菌数,结果见表1,益生菌释放完毕后,模拟肠液活菌数为原微囊活菌数的65.6%。

图6 微胶囊的肠溶性Fig.6 Enteric solubility of microcapsules

表1 R8微囊置模拟肠液中的存活率Table 1 The survival rate of probiotic in microcapsule under simulated intestinal

3 结论

采用喷雾法制备耐受胃液且具有肠道定向释放功能的副干酪乳杆菌R8微胶囊的最佳包埋液配方为:5%益生菌、2%菊粉、20%全蛋液、1%海藻酸钠;最佳固化液配方为:2.5% CaCl2。

副干酪乳杆菌R8与全蛋液、海藻酸钠混和均匀,进行第一层包埋,益生菌作为芯材被分散在壁材内部和表面;然后在进行固化的过程中,壳聚糖将首层的包埋材料覆膜,最终制得涂层基质型微胶囊。经上述工艺制得微胶囊可耐受胃液破坏,在模拟肠环境中45 min内释放完毕;益生菌释放完毕后,模拟肠液活菌数为原微囊活菌数的65.6%。

据试验结果可见,全蛋液既为冻干保护剂,亦为包埋壁材,在制备工艺过程起到保护作用,并提高在储存过程中的稳定性;将菌体/蛋白质/海藻酸钠微胶囊进一步用壳聚糖材料进行覆膜,可实现在肠道定向释放的目的。