金友兰，刘 安，肖文军,

（1.湖南农业大学 茶学教育部重点实验室，国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128；2.湖南省植物功能成分利用协同创新中心，湖南 长沙 410128）

茶叶深加工主要是指以茶叶生产过程中的茶鲜叶、茶籽、茶树修剪叶以及由其加工而来的半成品、成品或加工副产品等为原料，通过集成应用生物化学、生物工程、分离纯化工程、营养与卫生学与酶制剂等领域的先进技术及加工工艺[1]。随着茶叶深加工领域的不断拓展, 无论是茶饮料、速溶茶或是茶多酚等功能成分的提取都会产生大量的茶渣[2]。目前茶叶深加工中提取分离的有效成分尚局限于约占茶叶干重35%的水溶性物质[3]，而且在提取这些水溶性物质的过程中，也仅能获得其80%～90%的得率。茶叶中的不溶性多糖类物质占茶叶干重的20%～25%，主要是纤维素、半纤维素、淀粉和果胶等。通过生物降解技术，使不溶性糖转化为水溶性糖，并使水溶性糖得率最大化，是提高茶渣的综合利用效率、避免因茶渣的丢弃而造成环境污染的重要发展方向。我国目前对于茶渣的研究仍处于初级阶段，已有的研究集中在茶渣的成分分析、茶蛋白的初步提取及茶渣用作饲料、肥料等的研究[4]。

本试验采用的辐照处理，作为一种物理手段，可使纤维素聚合度下降、结构松散、反应可及度提高，具有处理时间短、操作简单、能耗低、不污染环境等优点[5]。目前鲜见此类研究，为此探索辐照预处理辅助纤维素酶降解绿茶水提茶渣制备水溶性糖的可行性，对资源综合利用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

绿茶茶渣由湖南金农生物资源股份有限公司提供；蒽酮、醋酸、醋酸钠均由国药集团化学试剂有限公司提供；纤维素酶（4×105U·g-1，其最佳作用pH值为4.8 左右，上海瑞永生物科技有限公司）；硫酸（80%，株洲市星空化玻有限责任公司）；WFJ-7200 型可见分光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司）；全温培养摇床（上海苏坤实业有限公司）；恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 辐照处理

提前将原料分装于玻璃瓶内，以60Co 为辐照源分别采用0 kGy、200 kGy、600 kGy、800 kGy、1000 kGy 和1200 kGy 的辐照剂量对其进行辐照处理。辐照后的样品封于铁盒中，室温下避光保存。

辐照后水提茶渣中还原糖提取：各称取1.5 g经上述剂量辐照后的茶渣放入10 mL离心管中，加入30 mL 的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，将离心管放入摇床，在50℃，130 r·min-1的条件下进行振荡，分别在反应后的52 h、54 h、56 h、58 h和60 h 时吸取上清液1 mL，过膜后装于2 mL离心管，制成待测液，分别测定其还原糖的含量。

1.2.2 茶渣酶解

分别称取0.15 g、0.25 g、0.35 g 的纤维素酶于10 mL 离心管中，并做好标记，加入30 mL的醋酸-醋酸钠缓冲溶液和1.5 g 未经辐照预处理的茶渣，盖好后置于50 ℃、130 r/min 可控温摇床中进行酶解，分别在反应后的4 h、6 h、8 h、10 h、24 h、29 h、48 h、72 h 和96 h 时统一提取1 mL 茶液样，测定其还原糖的含量。

分别称取未经辐照预处理的茶渣1.5 g 放入10 mL 离心管中，将离心管放入摇床，分别设置30℃、40℃、50℃、60℃，在130 r/min 的条件下进行反应，再统一对还原糖含量进行检测。

1.2.3 辐照预处理辅助纤维素酶水解

茶渣经不同剂量辐照处理后，分别称取1.5 g 茶渣样品加入已配有30 mL 缓冲液、0.25 g 纤维素酶的离心管中，于130 r/min、50℃的全温培养摇床中进行酶解反应，分别于第52 h、54 h、56 h、58 h 和60 h 进行取样，统一进行还原糖含量检测。

1.2.4 还原糖测定分析

还原性糖含量：待测液经适当倍数稀释后进行采样，用DNS 法对还原糖含量进行测定[6-7]。测定方法与步骤：将茶渣还原糖稀释适当倍数后备用。吸取上述待测液后用超纯水补至1 mL并加入4 mL DNS 试剂，同时以蒸馏水作空白对照，沸水浴显色10 min，取出冷却，以空白调零，在620 nm 处测定ABS值。

文中图表均采用origin 制图软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 纤维素酶对绿茶茶渣还原糖含量的影响

2.1.1 加酶量对茶渣还原糖含量的影响

在相同反步增加至0.35 g 时，还原糖产量水平与0.25 g 酶量的酶解效果相当。由此可知，增加酶量有利于在相同酶解时间段内的还原糖含量增加。当酶量由0.15 g 增加至0.25 g 时，还原糖产量呈上升趋势，当酶量达到0.35 g 时，由于受到底物的限制，还原糖含量不再提高。从经济节约的角度来考虑，加酶量可采用0.25 g。酶量对茶渣还原糖含量的影响如图1所示：

图1 加酶量对还原糖含量的影响Fig.1 Effectof the amount of enzyme on the content of reducing sugar

2.1.2 酶解时间对茶渣还原糖含量的影响

在酶解过程的前29 h，还原糖产量上升趋势较平缓，29 h～48 h 时，随着酶解时间的增加，还原糖的产量快速提高，48 h 达到最高，还原糖含量为214.649 mg，48 h 后呈下降趋势，96 h还原糖含量为153.847 mg。48 h 之后由于酶解时间过长，底物和酶量均减少，故还原糖含量逐渐减少，因此最适酶解时间应在48 h 左右，如图2所示。

2.1.3 酶解温度对茶渣还原糖含量的影响

随着酶解温度由30℃升高到50℃，还原糖含量明显上升，说明此时温度升高有利于酶解，而当温度进一步升高至60℃时，对酶解反应产生了明显的抑制作用，导致还原糖产量大幅度下降，主要是因为过高的温度使部分纤维素酶失活，由此可知纤维素的最佳酶解温度在50℃左右。酶解温度对茶渣还原糖含量的影响如图3所示。

图2 酶解时间对还原糖含量的影响Fig.2 Effect of enzymolysis time on the content of reducing sugar

图3 酶解温度对还原糖含量的影响Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on the content of reducing sugar

2.2 辐照对绿茶茶渣还原糖含量的影响

随着辐照剂量的增大，还原糖含量呈增加趋势，当采用1200 kGy 辐照处理，茶渣中的还原糖含量急剧增加，增加到98.610 mg/g，未经辐照的绿茶茶渣还原糖含量仅为9.611 mg/g，提高926.01%，该结果与何源禄等[8]研究结果一致。低剂量的辐照作用主要导致大分子聚合，高剂量的辐照作用会使物质结构变得疏松，使大分子降解为小分子物质，由此可知高剂量辐照对纤维素有更加明显的降解作用。辐照剂量对茶渣还原糖含量的影响如图4所示。

图4 辐照剂量对还原糖含量的影响Fig.4 Effect of irradiation dose on the content of reducing sugar

2.3 辐照预处理辅助纤维素酶水解对绿茶茶渣还原糖含量的影响

辐照处理能显著提高茶渣酶解效率。图5所示，对照样品在纤维素酶作用60 h 后，其还原糖含量仅为147.47 mg，而经不同辐照剂量处理的茶渣还原糖含量显著提高，较对照分别提高了1.2倍、1.2倍、1.5倍、1.5倍、1.3倍。在200～1200 kGy 剂量范围内，还原糖含量随剂量增大而增加，经800 kGy 辐照的茶渣和经1000 kGy 辐照的茶渣还原糖含量都在220 mg 左右，1200 kGy 辐照的茶渣还原糖含量反而较1000 kGy 低，约为194.60 mg。

图5 辐照-酶解对还原糖含量的影响Fig.5 Effects of irradiation and enzymatic hydrolysis on the content of reducing sugar

辐照预处理能提高茶渣酶解最开始的反应速度。52 h 对照组的还原糖含量仅为70.72 mg，而经200 kGy、600 kGy、800 kGy、1000 kGy、1200 kGy 辐照后的茶渣还原糖含量分别为131.71 mg、143.86 mg、128.57 mg、209.90 mg和175.71 mg。如图所示，辐照可以使酶解达到最大效率的时间缩短，800 kGy、1000 kGy 处理的茶渣反应58 h 后接近其反应60 h 时的水平，而1000 kGy 处理的茶渣则在56 h 时已经达到其最大的还原糖生产量。由此可见辐照辅助纤维素酶降解工艺要优于单独辐照处理或者酶解处理工艺，辐照预处理辅助酶解有利于提高纤维素的转化率。

3 讨论

以绿茶茶渣纤维素制备还原性糖，由于纤维质结构紧密，纤维素酶无法与其接触充分，酶解效率低且成本高。本试验采用辐照处理茶渣，使绿茶茶渣的主要组分物质发生了变化，其中一部分纤维素被直接降解为糖，同时改变了绿茶茶渣复杂的纤维素结构，增大了酶解反应时的物质接触面积，从而茶渣中水溶性还原糖含量增加。未经辐照预处理的对照处理茶渣还原糖含量仅为9.611 mg/g，而经1200 kGy 辐照处理的茶渣还原糖含量可以达到98.610 mg/g，提升926.01%，对照的还原糖含量达到最大值147.47 mg 需要60 h，而经过最佳辐照剂量1000 kGy 处理的茶渣酶解56 h 就能达到最大还原糖含量。

一方面辐照作为一种便捷高效的清洁能源，应用于纤维素材料的处理上，能有效提高转化率，降低转换成本。另一方面辐照处理也会对酶解反应起抑制作用。因此，辐照剂量并非越大越理想，试验结果也表明经800 kGy、1000 kGy 辐照处理的茶渣其反应效率要大于1200 kGy 辐照处理的茶渣。同时本研究表明辅助纤维素酶降解茶渣制备水溶性糖的工艺可行，该工艺具有一定的行业实用价值。