张 美，陈 超，刘 秋

(大连民族大学 生命科学学院，辽宁 大连 116600)

1 引言

随着世界工业的迅猛发展，石油资源被广泛利用。海上石油资源的开采、运输，以及石油泄漏事故等事件的频发，严重污染了海洋环境，破坏了海洋系统的生态平衡，威胁了人类的生命健康。在国家海洋局发布的《2010年中国海洋环境质量公报》中显示，面积约4.8万km2的近岸局部海域水质较差，劣于第4类海水水质标准，主要超标物质是活性磷酸盐、无机氮以及石油烃类物质[1]。在环境保护部发布的《2010年中国环境状况公报》中的海洋环境章节中提到，石油烃类物质是海水中的重要污染物之一，严重地威胁了海洋生态平衡；而在渤海，石油类污染源更是被作为主要的污染指标[2]。

至今，石油污染对环境造成的危害已经引起学者的广泛关注，用于处理石油污染的方法中，微生物修复因其修复费用低，不会造成二次污染等优点[3]，是目前具有广阔前景的重要修复技术[4～7]。长期以来，人们普遍认为石油烃污染修复只能在好氧条件下进行[8]，因此，研究学者多以好氧微生物为研究对象，对其降解特性、功能基因、代谢途径进行了系统的研究，取得了一定的研究进展[9～11]。但近年来，国内外的研究表明，厌氧微生物能够以硝酸盐、硫酸盐或金属离子等为电子受体，参加石油烃的代谢[12]。海底环境属于低氧甚至无氧状态，对于海洋极端环境，厌氧微生物或许有着比好氧微生物更重要的微生物修复任务，而对于海洋来源的厌氧石油降解菌的研究，还处于起步阶段。

本研究从大连新港石油污染海域海底沉积物中分离获得4株具有石油降解特性的厌氧微生物，根据16S rDNA基因序列同源性分析，初步确定了4株厌氧菌株的分类地位，并初步研究了4株菌株对原有的降解效果，为今后该属菌株应用于海洋石油污染的生物修复提供理论基础。

2 材料与方法

2.1 海洋厌氧石油降解菌的分离筛选

从大连新港石油污染地区采集海底沉积物样品，样品采集后，用海水封住上层，立即带回实验室，4 ℃保存。使用厌氧菌富集培养基进行富集实验，厌氧菌富集培养基(改良人造海水培养基(GL-ASM))：NaCl 30 g/L，MgSO40.35 g/L，KH2PO40.2245 g/L，微量溶液(浓缩100倍)100 μL/L，原油含量为150 μL/50mL，刃天青1 mL/L，半胱氨酸0.2 g/L，pH值为7.2左右，每250 mL厌氧瓶中分装50 mL厌氧菌富集培养基，高温加压灭菌(121 ℃，20 min)备用。固体平板分离培养基：上述GL-ASM培养基加琼脂18 g/L。

待灭菌结束后，取出厌氧瓶立即抽真空，充氮气(循环抽真空-充氮气5次)放入厌氧工作台，在每瓶培养液中加入 2 mL(约2 g)混匀的海洋沉积物样品。将处于厌氧状态下的厌氧培养瓶，利用注射器针头放气，使厌氧瓶中气压与外界保持一致，防止培养过程中有气体生成造成压力过大而使厌氧瓶炸裂。于30 ℃培养箱中静置培养7 d(每组设3个平行实验)。在固体平板分离培养基上用涂布法进行涂布，培养出单菌落，使用三线法在LB固体培养基上进行扩培，在30 ℃恒温的厌氧操作台里培养7 d直至长出菌落，多次划线分离纯化，直至获得微生物纯培养，制备20%甘油水溶液冻存管，于-70 ℃保存备用。LB培养基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH值为7.2左右。

2.2 菌株鉴定

2.2.1 海洋厌氧菌的DNA提取

将纯化菌株在LB液体培养基中培养，离心去除上清，沉淀即为菌体。取适量菌体加入TE buffer，加入一定量的溶菌酶(10 mg/mL)，37 ℃温浴30 min；加入50 μL 55 ℃预热的20%SDS和蛋白酶K(20 μg/mL)，55 ℃温浴1 h；加入550 μL的酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1的混合液，震荡混匀，12000 r/min离心10 min，吸取上清。重复上述步骤一次。加入2倍体积的无水乙醇于-20 ℃放置30 min，12000 r/min离心5 min，去除上清。加入200 μL的70%乙醇清洗DNA，12000 r/min离心5 min。待乙醇挥发干燥后，将DNA溶于50 μLTE buffer中，于-20 ℃保存。

2.2.2 16S rDNA的PCR扩增

合成细菌16S rDNA通用引物27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，1492R (5’-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3’)，用于PCR扩增反应，体系如下：ddH2O 37.5μL，10xPCR Buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，DNA 1 μL，27F 1 μL，1492R 1 μL，rTaq酶0.5 μL。PCR反应程序如下：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，共30个循环；72 ℃ 5 min。

2.2.3 系统发育树的构建

得到菌株的 16S rDNA 碱基序列后进行纯化并测序，将测序结果于 NCBI 数据库中比对分析，用MEGA7[13]软件构建系统发育树。

2.2.4 石油降解率的测定

以沸程60～90 ℃的石油醚为溶剂，配置成一系列的石油标准溶液，在紫外分光光度计225 nm处测定吸光值，以光密度为纵坐标，油浓度为横坐标，绘制标准曲线。

将4株菌株在LB液体培养基中培养，测定OD600=0.3左右，以5%接种量转接入50 mL GL-ASM液体培养基中，添加150 μL石油，在30 ℃厌氧恒温箱里培养7 d，同时设置不添加菌的液体培养基作为空白对照，每组实验设3次重复。培养结束后，每瓶培养体系中加入20 mL石油醚进行第一次提取，留上层溶液，下层溶液进行第二次提取。第二次萃取加入15 mL石油醚，第三次加入10 mL石油醚；共提取三次。每次提取充分混匀，提取时间为20 min。将三次萃取溶液离心(10000 r/min)，取上相定容至50 mL容量瓶中。取100 μL萃取液溶于4.9 mL的石油醚中，波长225 nm下紫外检测吸光值。

紫外比色法：225 nm条件下，测定吸光值，根据以下公式进行降解率的计算：

(1)

式(1)中：MC为对照组石油含量(单位：mg)；MO为实验组石油含量(单位：mg)。

3 结果与讨论

3.1 菌株鉴定

对获得的4株菌株16S rDNA进行测序，并于NCBI上进行比对分析，结果表明4株菌株均属于Vagococcus属。使用MEGA7.0对4株菌株进行系统进化树的构建结果如图1所示。4株菌株的进化关系较近，与菌株Vagococcus fluvialis CCUG 32704T相似度最高，4株菌株之间处于同一分支，100%自展值表明该支稳定，且4株菌株之间有一定的进化距离，表明4株菌株属于Vagococcus属的不同菌株，将菌株分别命名为Vagococcus sp.08，Vagococcus sp.11，Vagococcus sp.26，以及Vagococcus sp.38。其中，Vagococcus sp.11与模式菌株Vagococcus fluvialis CCUG 32704T的进化地位最相近。

图1 4株菌株16S rDNA序列N-J系统发育分析

3.2 石油降解特性分析

对4株海洋厌氧菌的石油降解能力进行测定，石油降解标准曲线如图2所示。采用紫外法测定微生物降解后培养基中剩余的石油量，并计算降解率。实验结果表明，Vagococcus sp.08，Vagococcus sp.11，Vagococcus sp.26，以及Vagococcus sp.38均能以石油为唯一碳源生长，其石油降解率依次为23.78%、31.20%、32.11%和44.31%(图3)。其中，以Vagococcus sp.38的石油降解性能最高，达到44.31%。

Vagococcus属是一类独特的革兰氏阳性细菌，第一株菌株发现于1989年，并命名为Vagococcus fluvialis(河流漫游球菌)[14]，该属菌株通常在水生动物体中分离获得，目前研究主要是针对该菌作为益生菌的潜能开发，如Sorroza L等[15]从不同鱼类体内分出50多种细菌，研究发现只有Vagococcus fluvialis能够较好的抵抗鱼类易染病菌，大大提高鱼类的存活率，Román L等[16]研究发现Vagococcus fluvialis对研究物种的免疫系统有刺激作用，因此，该菌具有开发成水产益生菌的潜能。本研究首次从石油污染海底沉积物中分离获得该属石油降解厌氧微生物菌株，且目前还未有研究报道Vagococcus属的菌株具有石油降解特性，本研究首次报道了该属厌氧微生物菌株能够以石油为唯一碳源生长，证实了其在海洋污染修复治理中的生态作用。

图2 石油降解标准曲线

图3 4株菌株石油降解率

4 结论

研究从大连新港石油污染海域海底沉积物中分离获得4株能够降解石油的厌氧微生物菌株，经鉴定发现4株菌株均与模式菌株Vagococcus fluvialis CCUG 32704T相似度最高，且4株菌株之间有一定的进化距离。石油降解性能分析发现，4株菌株均具有石油降解特性，首次发现并报道了Vagococcus属的石油厌氧降解菌。且发现，该属的4株菌株的石油降解率有所不同，研究表明，虽然菌株进化地位十分相近，但其代谢机制仍有所不同，石油降解性能差异显著。该结果为今后海洋石油污染的厌氧微生物修复奠定研究基础。