（绥化学院食品与制药工程学院，黑龙江绥化152061）

玉米须是禾本科作物玉米的花柱和柱头，是一种传统的中药材，玉米须中含有丰富的功能性成分如多糖、黄酮、皂甙、多酚等，具有降压、降血糖、抗癌细胞增殖、止血、利尿、抗氧化等多种作用[1-3]，然而玉米须通常被作为废弃物丢掉，不仅污染环境，而且造成资源浪费[4]。超临界二氧化碳萃取技术作为一种新型绿色分离提取技术，凭借其萃取温度低、萃取能力强、萃取效率高等优点被广泛应用于功能性物质的提取方面[5-7]。试验以玉米须为原料，以玉米须多酚提取量为评价指标，优化超临界二氧化碳提取玉米须多酚的工艺条件，并对其进行抗氧化性研究，为玉米须多酚提取及作为天然抗氧化剂的进一步应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

玉米须：采自绥化市农田，清洗、晾干，粉碎过筛；没食子酸标准品（含量：99%）：天津市光复精细化工研究所；DPPH（分析纯）：美国sigma公司；2，6-二叔丁基对甲酚（butylated hydroxytoluene，BHT）（化学纯）：上海埃彼化学试剂有限公司；抗坏血酸（VC）（分析纯）：无锡市亚泰联合化工有限公司；福林酚试剂、无水乙醇（分析纯）、碳酸钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器及设备

Spe-ed SFE超临界CO2萃取仪：美国ASI公司；TU-1901双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；XH-C漩涡混合器：江苏省金坛市指前镇旭日实验仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 萃取方法

称取粉碎后的玉米须10 g，装入萃取釜中，加夹带剂乙醇充分浸润，按单因素及中心组合设计，进行超临界CO2静态结合动态萃取多酚，萃取结束后，收集多酚提取物，定容后进行总酚含量的测定。

1.3.2 单因素试验

1.3.2.1 萃取压力对玉米须多酚提取量的影响

萃取温度45℃，夹带剂为75%乙醇水溶液，料液比 1∶1.5（g/mL），萃取时间为静态萃取 1.5 h，再动态萃取 0.5 h，考察萃取压力 30、35、40、45、50 MPa 对玉米须多酚提取量的影响。

1.3.2.2 萃取温度对玉米须多酚提取量的影响

萃取压力35 MPa，夹带剂为75%乙醇水溶液，料液比1∶1.5（g/mL），萃取时间为静态萃取 1.5 h，再动态萃取 0.5 h，考察萃取温度 35、40、45、50、55 ℃对玉米须多酚提取量的影响。

1.3.2.3 萃取时间对玉米须多酚提取量的影响

萃取压力35 MPa，夹带剂为75%乙醇水溶液，料液比 1∶1.5（g/mL），萃取温度 50℃，静态萃取一定时间后，再动态萃取0.5 h，考察静态萃取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h对玉米须多酚提取量的影响。

1.3.2.4 夹带剂乙醇浓度对玉米须多酚提取量的影响

萃取压力 35 MPa，料液比 1 ∶1.5（g/mL），萃取温度50℃，静态萃取时间1.5 h，考察夹带剂乙醇浓度45%、55%、65%、75%和85%对玉米须多酚提取量的影响。

1.3.3 中心组合试验

在单因素试验的基础上，选取对多酚提取影响显著的3个因素即萃取压力（X1）、萃取温度（X2）及夹带剂乙醇浓度（X3）进行中心组合设计试验[8]，以多酚提取量为评价指标，确定最佳提取工艺条件，因素水平编码见表1。

表1 响应面试验因素和水平编码值Table 1 Coded values and corresponding real values of the optimization parameters tested in response surface analysis

1.3.4 没食子酸标准曲线及多酚提取量的测定

采用福林酚比色法测定[9]。将没食子酸作标准品配制成浓度为0.10 mg/mL的标准液，分别吸取没食子酸标准液 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于 10 mL 容量瓶中，用去离子水定容。吸取上述不同浓度没食子酸溶液各1 mL，依次加入0.30 mL福林酚试剂、1.5 mL饱和Na2CO3溶液，加水定容至10 mL，摇匀、室温下静置20 min，于760 nm处测吸光值，建立标准曲线，得回归方程 y＝0.1171x＋0.041 4，相关系数 R2=0.996 1。将玉米须多酚的超临界CO2萃取物稀释至适宜浓度后，吸取1 mL样液，按照上述方法测定，利用标准曲线回归方程计算多酚提取量。

1.3.5 玉米须多酚的抗氧化试验

将最优条件下萃取得到的多酚配成质量浓度为50、100、150、200、250 μg/mL 的多酚溶液进行 DPPH 自由基清除效果的测定，以相同浓度的VC和BHT作对照，测定方法参考Shimada等的方法进行[10]。

1.3.6 数据处理

每个试验重复3次，结果表示为x±s，采用Sigmaplot 11.0软件作图及Design-Expert 8.0软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 萃取压力对玉米须多酚提取量的影响

萃取压力对玉米须多酚提取量的影响结果见图1。

图1 萃取压力对玉米须多酚提取量的影响Fig.1 Effect of extraction pressure on extraction amount of corn silk polyphenol

从图1看出，随着萃取压力的增加，多酚提取量逐渐增加，当压力达到35 MPa时，提取量达到最大为8.43 mg/g，再随着压力的增加，提取量反而下降，这可能是因为较高的压力使CO2密度增加，进而更多的溶质溶于其中，利于多酚的萃取[11]，然而当萃取压力过高时，不仅传质阻力增大，而且夹带剂乙醇分子在高压下可能发生凝聚而导致溶质的溶解性降低[12]，进而使多酚提取量下降。

2.1.2 萃取温度对玉米须多酚提取量的影响

萃取温度对玉米须多酚提取量的影响结果见图2。

图2 萃取温度对玉米须多酚提取量的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction amount of corn silk polyphenol

从图2看出，随着萃取温度的增加，溶质的扩散能力增加，利于多酚的提取，当温度为50℃时，提取量最高，随着温度的继续升高，CO2密度降低，溶质的溶解度降低[13]，进而多酚的提取量降低，因此多酚萃取的最佳温度为50℃。

2.1.3 萃取时间对玉米须多酚提取量的影响

萃取时间对玉米须多酚提取量的影响结果见图3。

图3 萃取时间对玉米须多酚提取量的影响Fig.3 Effect of extraction time on extraction amount of corn silk polyphenol

从图3看出，随着萃取时间的延长，玉米须多酚提取量逐渐升高，萃取时间达1.5 h，萃取过程基本平衡，随着时间的增加，提取量反而略有下降，可能是在密闭环境下，温度和压力的协同作用对多酚物质造成了破坏[14]，因此，选定最适宜的时间为1.5 h。

2.1.4 夹带剂乙醇浓度对玉米须多酚提取量的影响

乙醇浓度对玉米须多酚提取量的影响结果见图4。

图4 乙醇浓度对玉米须多酚提取量的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on extraction amount of corn silk polyphenol

玉米须多酚分子极性较大，难溶于CO2中，借助夹带剂乙醇水溶液可以提高超临界流体对多酚的溶解性[15]。从图4看出，随着乙醇浓度的增加，玉米须多酚的提取量增加，当乙醇浓度为75%时，萃取效果最好，随着乙醇浓度的继续增加，多酚提取量反而下降，可能是因为较高的乙醇浓度由于其含水量的减少，细胞通透性变差，多酚不易向外扩散，进而使提取量降低，因此夹带剂乙醇浓度以75%为最佳。

2.2 响应面优化分析

根据Box-Behnken中心组合设计原理，以玉米须多酚提取量为考察值，进行三因素三水平共15个试验点（3个中心点）的响应面分析试验[16]，试验结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

通过Design-Expert 7.0软件对响应值与各因素进行多元回归拟合，得到以玉米须多酚提取量为目标函数的二次回归方程：

回归模型方差分析见表3。

从表3看出，萃取压力和萃取温度对玉米须多酚提取量的影响极显著（P＜0.01），萃取压力的影响大于萃取温度，而且二者的交互作用也达到显著水平（P＜0.05），说明萃取压力和萃取温度的相互作用对玉米须多酚提取量有显著影响。回归模型P=0.003 4＜0.01，达到极显著水平，说明该方程能准确反映多酚提取量与各因素之间的关系，失拟项P=0.632 4＞0.05，不显著，说明方程对试验拟合良好，试验误差小，相关系数R2=0.960 8，说明有96.08%的数据可以用此回归模型来解释。最终由回归方程得到的最高指标时各个因素的组合：Y=8.685 06，X1=36.81，X2=54.73，X3=75.65，即萃取压力36.81 MPa，萃取温度54.73℃，夹带剂乙醇浓度75.65%，在此条件下，玉米须多酚的提取量为8.685 06 mg/g。

表3 回归模型方差分析Table 3 The results of variance analysis using the regression

图5 萃取压力、萃取温度的响应面及等高线图Fig.5 Response surface plot and contour plot for interactive effect of extraction pressure and extraction temperature on extraction amount of polyphenol

根据回归分析结果做响应面图及其等高线图见图5到图7。

图6 萃取压力、乙醇浓度的响应面及等高线图Fig.6 Response surface plot and contour plot for interactive effect of extraction pressure and ethanol concentration on extraction amount of polyphenol

图7 萃取温度、乙醇浓度的响应面及等高线图Fig.7 Response surface plot and contour plot for interactive effect of extraction temperature and ethanol concentration on extraction amount of polyphenol

拟合的响应面和等高线图能比较直观地反映各因素间的交互作用对响应值的影响。从图中看出，萃取压力和萃取温度交互作用显著，萃取压力和乙醇浓度交互作用最小。通过对响应面图的陡峭程度分析可知，萃取压力对多酚提取量影响最大，乙醇浓度的影响相对最小，这一结果与方差分析结果一致。

为检验预测结果的可靠性，采取最优条件对玉米须多酚进行提取，考虑到实际操作的便利，将提取工艺参数修正为萃取压力37 MPa，萃取温度55℃，夹带剂乙醇浓度为76%，3次平行试验得到实际的提取量为8.54 mg/g，与最优理论值相近，说明响应面优化的工艺参数准确可靠，具有可行性。

2.3 玉米须多酚对DPPH自由基的清除效果

不同浓度的玉米须多酚、VC和BHT对DPPH自由基清除率的影响见图8。

从图8中看出，随着玉米须多酚、VC和BHT各自浓度的增加，DPPH自由基的清除效率逐渐增加，虽然在较低浓度（50 μg/mL 和 100 μg/mL）时，玉米须多酚的清除效果劣于BHT和VC（P＜0.05），但当浓度达到250 μg/mL 时，三者抗氧化效果相当（P ＞0.05），说明玉米须多酚具有一定的抗氧化能力。

图8 玉米须多酚与VC和BHT对DPPH自由基的清除能力Fig.8 The scavenging activity of corn silk polyphenol，VCand BHT on DPPH·

3 结论

超临界CO2萃取玉米须多酚的最佳工艺为萃取压力37 MPa，萃取温度55℃，夹带剂乙醇浓度76%，静态萃取时间1.5 h，动态萃取时间0.5 h，在此条件下，玉米须多酚提取量为8.54 mg/g。超临界流体萃取工艺简单、绿色高效，得到的玉米须多酚能够作为一种天然抗氧化剂应用于食品中，具有一定的发展前景。