刘菲 胡玉婷 刘静 毛若颖 陶欣荣

摘要：目的  本研究通过摇床法分离纯化培养小鼠原代小胶质细胞，并研究尼古丁对小胶质细胞肿瘤坏死因子α（TNF-α ）的表达和分泌的影响。方法  從C57 BL/6新生鼠大脑中分离出皮层，切碎研磨后进行混合培养，摇床法分离纯化小胶质细胞并培养。CD11b、Iba1作为小胶质细胞特异性标记物用来检测、鉴定小胶质细胞，在激光共聚焦显微镜下观察、计数免疫荧光细胞化学染色后的阳性细胞。将纯化的小胶质细胞设置为三个组，分别为空白对照组，LPS组，LPS+NIC组。 LPS+NIC组先加入10 ug/ml LPS处理30 min，再加入10 μmol 尼古丁处理24 h。LPS组加入10 μg/ml LPS处理4 h。空白对照组不做任何处理。使用qPCR检测尼古丁对小胶质细胞TNF-α的表达，酶联免疫吸附实验检测尼古丁对小胶质细胞TNF-α分泌的影响。结果  培养混合细胞，再通过摇床法收获的小胶质细胞，细胞阳性率超过95.54%。免疫荧光细胞化学方法鉴定小胶质细胞纯度，小胶质细胞特异性标志物CD11b、Iba1，星形胶质细胞标志物GFAP检测结果，ImageJ分析小胶质细胞阳性率>95.54%，星型胶质细胞<4%，其它细胞<2%;LPS处理组与LPS+NIC处理组相比较，LPS+NIC组TNF-α的RNA水平的表达明显降低，且差异有统计学意义（P<0.05）;LPS单独处理组，小胶质细胞TNF-α分泌增加。而LPS+NIC组小胶质细胞TNF-α分泌降低，两组TNF-α分泌有明显差异，且有统计学意义（P<0.05）。结论  利用差异贴壁，分离纯化得到了高纯度的小鼠原代小胶质细胞，相较于其它方法，对细胞的损伤小，可多次收获小胶质细胞，细胞得率高。尼古丁可抑制小鼠原代小胶质细胞TNF-α 的分泌，可能为神经退行性疾病的治疗提供新的治疗方法。

关键词：小胶质细胞;原代培养;尼古丁;肿瘤坏死因子

中图分类号：R322.81                                文献标识码：A                                 DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.02.031

文章编号：1006-1959（2019）02-0111-04

炎症反应（inflammatory reaction）是由先天免疫系统对抗内源性和外源性的损伤形成身体的自卫机制。小胶质细胞是中枢神经系统中胚胎来源的自我更新组织的巨噬细胞，在大脑、脊髓、视网膜和嗅球中均有存在[1]。小胶质细胞有多种功能，包括支持中枢神经系统发育和突触形成、维持体内平衡、对感染源的免疫反应，以及参与成人神经形成、神经炎症、退行性疾病、中风、创伤和再生[2]。当小胶质细胞被激活后，往往伴随神经炎症反应的发生。这种神经炎症反应可能通过清除神经毒性因子起到神经保护作用[3]，但它们也可能通过促炎介质和氧化应激水平升高导致神经变性，以及神经递质水平改变，而成为神经毒性，致使神经元死亡，记忆减少和海马功能障碍[3-5]。已有证据显示尼古丁在神经退行性疾病的治疗过程中可以产生有利的影响[6]。小胶质细胞在调节炎症反应的内源性神经免疫机制中，起着重要作用。本实验通过摇床法分离纯化小胶质细胞，并探索尼古丁对小胶质细胞参与的炎症反应的作用。

1材料

1.1实验动物与仪器  实验动物购于常州卡维昂公司（许可证号SCXY（Su）2011-0003）6～8周SPF级C57 BL/6小鼠，雄性小鼠3只，雌性小鼠9只。离心机（平凡仪器，TDZ5-WS），摇床（DragonLAB，SK-D1807-E），细胞培养箱（ESCO，CCL-170B-8），显微镜（Leica），共聚焦显微镜（Olympus，FV1000）

1.2实验材料与试剂  60×15 mm细胞培养皿（corning），六孔板（corning），25 m2细胞培养瓶（T-25 flask，Thermo）， 腔室载玻片（Lab-TekII Chamber Slide，8 wells），胎牛血清（FBS，Gibco），胶质细胞基础培养基（DMEM /High glucose，HyClone），青霉素-链霉素（Penicillin/Streptomycin，Gibco），L-15条件培养基（Leibovitz's L-15 conditioned media），牛血清白蛋白（BSA），0.9%氯化钠注射液，无水乙醇（上海试剂一厂），anti-Iba1 antibody（Wako;# 019-19741），anti-CD11b antibody（biolegend;#101201），anti-GFAP antibody（abcam;#ab7260）， 山羊抗兔IgG（H&L）二抗 （Alexa Fluor  594;life technology），山羊抗大鼠IgG（H&L）二抗 （Alexa Fluor  488;life technology）， 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，碧云天），免疫荧光防淬灭剂（碧云天）

2方法

2.1混合胶质细胞的取材与培养  喂养6～8周SPF级C57 BL/6小鼠，适应2周，雌雄3∶1配对，待雌鼠怀孕后分笼。取材器械高压灭菌，取雌鼠所生2～4 d新生鼠8只。放入75%酒精中浸泡消毒。取出小鼠，用剪刀剪断小鼠头部，并转入75%酒精中再次消毒2 min，之后转入0.9%氯化钠注射液浸泡2 min，在60×15 mm平皿中加入 L-15（L-15+0.1%BSA+1%pen/strep）条件培养基，将浸泡在0.9%氯化钠注射液中的小鼠脑转入其中。剥离新生鼠脑膜，取出大脑皮层在新的L-15条件培养基中轻柔切碎组织，并转入15 ml离心管，4℃，2000 r/min，离心5 min，弃去上清。所有实验步骤均需在冰上操作。用5～6 ml小胶质细胞完全培养基（DMEM+10%FBS+1%pen/strep）重悬细胞，准备5个T-25 flask，各加入已预热（37℃）的小胶质细胞完全培养基3 ml，将15 ml离心管中细胞上下吹打10次，并转移至已准备好的5个T-25 flask中，每瓶1 ml。5%CO2，37℃培养箱，培养5 d，全量换液，以后每隔3 d半量换液[7]。

2.2小胶质细胞分离培养  Poly-L-Lysine（PLL）包被Lab-TekII Chamber Slide（8 wells）。混合細胞培养14 d后取出，用封口膜封闭培养瓶瓶盖，置于摇床上，在100 rps ，37℃条件下摇晃3 h。摇晃结束后吸取培养液，置于15 ml离心管中，4℃，2000 r/min，离心5 min。在原来的T-25 flask中仍加入小胶质细胞完全培养基，放入培养箱，继续培养（每瓶flask可进行4～5次小胶质细胞分离）。弃离心管中上层液体。用小胶质细胞培养液重悬，种于已包被腔室载玻片及12孔板（5×106 ml-1）中。

2.3免疫荧光细胞化学染色  实验孔中加入10 μg/ml LPS处理4 h。取种于腔室载玻片中的小胶质细胞，PBS洗3次，每次5 min。放入4%多聚甲醛（PFA）对细胞进行固定，20 min后用 PBS洗涤，每次5 min，共3次。0.1%聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）透膜处理5 min。弃去液体，将腔室载玻片置于湿盒内，加入5%山羊血清，室温封闭30 min。加入一抗CD11b（1∶200），Iba1（1∶500），GFAP（1∶500）置于湿盒，4℃过夜孵育。将腔室载玻片从湿盒中取出，复温10 min。PBS洗3次，每次5 min。加入二抗Goat anti-Rat IgG H&L（1∶1000），Goat anti-rabbit IgG H&L（1∶1000）置于湿盒内，室温孵育30 min。PBS洗3次，每次5 min。DAPI（1∶2000）染核10 min。PBS洗3次，每次5 min，免疫荧光防淬灭剂封片，晾干后置于荧光显微镜观察。

2.4尼古丁抑制激活状态下小胶质细胞TNF-α分泌

2.4.1尼古丁处理 设置三个组，分别为空白对照组，LPS组，LPS+NIC组。 LPS+NIC组先加入10 ug/ml LPS处理30 min，再加入10 μmol 尼古丁处理24 h。LPS组加入10 μg/ml LPS处理4 h。空白对照组不做任何处理。

2.4.2 qPCR检测原代小胶质细胞中TNF-α的表达  从培养箱中取出6孔板（收集上清用于ElISA检测），在已清空上清的12孔板中加入Trizol，提取细胞总RNA，测定RNA浓度。利用5X All-in-one RT master Mix（abm）试剂盒将RNA逆转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，Go Taq qPCR Master Mix试剂盒（Promega）测定不同组细胞TNF- 的RNA表达。TNF- 引物上游5'-TTGTCTACTCCCAGGTTCTCT-3'，下游5'-GAGGTTGACTTTCTCCTGGTATG-3'，GAPDH引物上游5'-GTGGGTGCAGCGAACTTTAT-3，下游5'-CACTGAGCATCTCCCTCACA-3'。设置条件95℃ 10 s，58℃ 60 s，40个循环。

2.4.3 ElISA检测小胶质细胞TNF-α的分泌  收集细胞的上清液，放入离心机中，4℃，3000 r/min，离心20 min。ElISA试剂盒检测小胶质细胞TNF-α分泌。

2.5统计学处理  采用SPSS软件进行统计分析，非配对t检验进行分析，当P<0.05时，认为差异有统计学意义。

3结果

3.1混合胶质细胞培养  混合胶质细胞培养第6天，可看到少部分小胶质细胞伸出突触，多数为圆形，透光性较好的细胞（图1A）。混合细胞培养14 d后细胞密度增加，出现分层，上层圆而亮的细胞，为小胶质细胞，呈悬浮或半悬浮生长，下层贴壁较紧的为星形胶质细胞（图1B）。经摇床震荡下的细胞重新铺板后可发现细胞全部为亮圆的细胞，细胞多数悬浮于培养液中（图1C）。细胞培养重新铺板24 h后，可见细胞伸出突触贴壁生长（图1D）。

3.2小胶质细胞鉴定  免疫荧光细胞化学方法鉴定小胶质细胞纯度，小胶质细胞特异性标志物CD11b、Iba1，星形胶质细胞标志物GFAP检测结果，ImageJ分析小胶质细胞阳性率>95.54%（图2A-B，2D），星型胶质细胞<4%（图2C，2D），其它细胞<2%（图2D）。

3.3尼古丁处理小胶质细胞  LPS处理组与LPS+NIC处理组相比较，LPS+NIC组TNF-α的RNA水平的表达明显降低，且差异有统计学意义（P<0.05）（图3）;LPS单独处理组，小胶质细胞TNF-α分泌增加。而LPS+NIC组小胶质细胞TNF-α分泌降低，两组TNF-α分泌有明显差异，且有统计学意义（P<0.05）（图4）。

4讨论

小胶质细胞占人类大脑5%～15%，作为脑内的“监视”细胞，参与各类替代修复反应[6]。小胶质细胞处于稳态时（M0型），也会持续以其高能运动性影响中枢神经系统。当暴露于特定的生长因子或细胞因子时，小胶质细胞表型改变为激活状态（M1型），这种表型长期以来与神经炎症有关。在体外小胶质细胞暴露于某些抗炎细胞因子后可以诱导产生另一种表型（M2型）[8]。因此建立一种体外培养较高产量的原代小胶质细胞至关重要，它可提供足够的细胞用于炎症发生机制、药物作用效果等的研究。原则上小胶质细胞可以由大脑的任何一个部分培养而成，但是通过本实验发现大脑皮层培养的小胶质细胞相较于全脑而言纯度大大提高。在取材时，尽量少用或不用剪刀，细胞筛等，以减少带来的物理伤害（本实验未用依然培养纯度较高的小胶质细胞）。脑内的神经元细胞与神经胶质细胞互相影响[9]。因此，在混合细胞培养的前5 d，不需要换液并避免移动细胞，让各种神经细胞在培养基中着床生长。混合胶质细胞培养14 d后，利用摇床，将上层贴壁较浅的小胶质细胞通过物理方法分离，此方法分离纯化的细胞数量与细胞纯度较高。分离的小胶质细胞在铺板24 h后贴壁，并伸出突起。经免疫荧光化学方法鉴定细胞纯度在95%以上。

LPS 是一种免疫刺激剂，通过实验可以看出， LPS刺激小胶质细胞后，小胶质细胞肿瘤坏死因子TNF-α表达明显增多。在神经退行性疾病中可以看到小胶质细胞迅速增殖并发生形态学改变，并且人类大脑组学研究表明，小胶质细胞的这种变化是神经退行性疾病表观遗传信号的重要组成部分[10]，因此找到抑制小胶质细胞过度活化的方法是恢复神经退行性疾病的重要靶点。本实验根据既往研究结果，在LPS激活的小胶质细胞中加入尼古丁，可以看到小胶质细胞TNF-α的表达降低。尼古丁通过调节免疫反应对机体能够产生一些有利的影响，从而抑制炎症反应的发生。蛋白质合成，翻译后修饰和清除的机制（蛋白质稳态）在中枢神经系统中失调是许多神经退行性疾病的特征[11]。阿尔茨海默症（AD）其病理学特征即表现为，蛋白稳态丧失，导致β-淀粉样蛋白（Aβ）沉淀，Tau蛋白异常磷酸化形成神经元纤维缠结[12]。减少β-淀粉样蛋白（Aβ）诱导的小胶质细胞的激活被认为是有效治疗阿尔茨海默症（AD）的关键[13]，吸烟者帕金森病（PD）的患病率低于不吸烟者已被证明[14]，但尼古丁对神经保护作用的机制尚不清楚。调节小胶质细胞的激活，可能作为潜在治疗神经系统疾病的一种手段[15]，因而尼古丁抑制小胶质细胞激活对神经元起到保护作用的机制有待进一步研究。

本研究借鉴现有小胶质细胞纯化培养、摇床分离差异贴壁神经胶质细胞的方法，建立高效纯化小鼠原代小胶质细胞的方法，并定量分析尼古丁对小胶质细胞炎性因子TNF-α分泌的影响。为进一步研究小胶质细胞在炎症反应中的作用奠定基础。

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收稿日期：2018-11-30;修回日期：2018-12-23

編辑/肖婷婷