黄桢雅 陈俊男 赖琳英 周桂文 周云超 梁黎明 陈敏亮

[摘要]目的：探讨在-80℃低温条件下冻存不同时间的脂肪组织颗粒的结构及生物学活性变化。方法：将吸脂后的脂肪经过洗涤、离心后低温保存，1周、4周、8周、12周、16周、20周、24周后，对复温后的脂肪组织颗粒进行大体观察、组织学观察、活性检测、SVF细胞培养等。结果：随冻存时间的延长，脂肪组织的结构及生物学活性逐步下降，冻存1周的脂肪组织活细胞面积（35.35±4.05）%较新鲜脂肪（79.25±7.44）%显著减少，差异有统计学意义（P<0.01），冻存1周的脂肪细胞较新鲜脂肪细胞线粒体活性显著下降（P<0.01），SVF细胞培养，冻存脂肪来源的贴壁细胞数量较新鲜脂肪显著减少（P<0.01），且细胞生长缓慢、状态较差。结论：大多数脂肪细胞在一次冷冻保存过程中便失活，而冻存时间的延长与脂肪细胞活性降低的相关性并不明显，不推荐临床使用不添加保护剂直接冻存的脂肪进行移植。

[关键词]脂肪组织;低温保存;冷冻;脂肪移植;细胞形态;细胞活力

[中图分类号]R622    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2019）02-0014-04

Abstract： Objective  The aim of this study was to observe the changes of histological structure and biological activity of adipose granules frozen at -80℃ for different time. Methods  The adipose tissue obtained by liposuction was stored at low temperature after washing and centrifugation. After 1 week， 4 weeks， 8 weeks， 12 weeks， 16 weeks， 20 weeks and 24 weeks， the granules of adipose tissue after rewarming were observed by gross observation， histological observation， activity detection， SVF cell culture and so on. Results  With the prolongation of freezing time， the histological structure and biological activity of fat gradually decreased. The area of living cells in adipose tissue frozen for 1 week （35.35±4.05）% was significantly lower than that of fresh adipose tissue （79.25±7.44）%， the difference was statistically significant（P<0.01）. The mitochondrial activity of adipocytes frozen for 1 week was significantly lower than that of fresh adipocytes （P<0.01）. In SVF cell culture， the number of adherent cells derived from cryopreserved fat was significantly lower than that of fresh fat （P<0.01）， and the cells grew slowly and in poor condition. Conclusion  Most adipocytes are inactivated during a single cryopreservation. There was no significant correlation between the prolongation of freezing time and the decrease of adipocyte activity. It is not recommended to transplant directly frozen fat without protective agent in clinic.

Key words： adipose tissue; cryopreservation; freezing; fat transplantation; cell morphology; cell viability

人自體脂肪组织颗粒是外科领域常用的软组织填充材料，将其移植以治疗软组织凹陷的效果已得到医生及患者的肯定。而目前无法一次治疗就达到满意效果的主要原因是脂肪的高吸收率，甚至可高达70%[1]。临床上仍需要通过少量、多次的移植以达到最终治疗效果。除此之外，脂肪组织中含有丰富的脂肪干细胞（Adipose derived stem or stromal cells，ADSCs），使其在再生医学中的应用也日渐得到重视。故如何将脂肪组织体外有效地长期保存以备日后所需，是值得学者们研究的问题。根据以往的冻存脂肪相关研究[2-6]，确有不少有差异甚至矛盾的结果。本研究主要从冻存时长的角度切入，将人脂肪组织颗粒保存在-80℃环境中，冻存不同时间后观察复温后脂肪组织的生物学性状改变，以期为冻存脂肪的进一步优化及标准化提供相关理论参考和基础性的实验依据。

1  材料和方法

1.1 临床组织标本

1.1.1 人自体脂肪组织颗粒临床样本来源：本实验所用标本均取自于中国人民解放军总医院第四医学中心烧伤整形科，供者为进行吸脂术的健康成年女性，年龄24～38岁，取脂部位为腹部及大腿。实验样本的采集均经过患者本人知情同意，并经医院机构审查委员会批准。

1.1.2 脂肪组织颗粒获取与纯化：供区肿胀麻醉后，使用侧孔直径1mm、针管直径3mm的多侧孔吸脂针，连接20ml注射器进行吸脂。使用林格氏液漂洗获取脂肪组织颗粒，并剔除粗大纤维结缔组织，垂直静置分层后去除下层的肿胀液及血液混合物（此过程可重复操作多次）。之后于温控离心机中以1 000r/min离心3min。弃掉上层的油脂及底层液体，保留中层脂肪组织。

1.2 试剂和仪器

1.2.1 试剂：HE染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），Anti-Perilipin-1抗体（英国Abcam），山羊Anti-Rabbit IgG H&L（Alexa Fluor? 647）（英国Abcam），DAPI（北京索莱宝科技有限公司），Ⅰ型胶原酶（美国Gibico），胰蛋白酶（美国Invitrogen），PBS缓冲液，胎牛血清（美国Gibico），青链霉素（北京索莱宝科技有限公司），低糖DMEM培养液（美国Gibico），Cell Counting Kit-8（上海碧云天生物技术有限公司）。

1.2.2 主要仪器：离心机，CO2培养箱（37℃，5%CO2），恒温水浴箱，倒置显微镜，共聚焦显微照相系统，普通家用冰箱，超低温冰箱，切片机，超净工作台，酶联免疫检测仪。

1.3 方法

1.3.1 实验分组：将纯化后的脂肪组织颗粒，随机分为8组。1组新鲜脂肪组织颗粒作为对照组，其余脂肪组织颗粒按冻存时长的不同分为1周组、4周组、8周组、12周组、16周组、20周组、24周组。

1.3.2 脂肪组织颗粒冻存与复苏：①冻存：纯化后的脂肪组织颗粒分装于无菌离心管中，4℃平衡30min后，移入-20℃冰箱，4h后移入-80℃深低温冰箱保存;②复苏：取出冻存的脂肪，置于37℃水浴箱中快速震荡复温，静置后去除上层油脂，获得纯脂肪组织颗粒。

1.3.3 组织学检测：每组各取5份0.5ml复温后的脂肪组织颗粒，用滤纸包裹后，经过固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片等步骤，制作成石蜡切片。①HE染色：常规苏木素伊红染色，观察脂肪细胞的细胞形态;②免疫荧光染色：脂滴包被蛋白（Perilipin）是一种包被于脂滴表面的脂肪代谢相关蛋白，通过染色活脂肪细胞标志蛋白Perilipin以评估脂肪细胞活力[7];使用一抗兔抗Perilipin和二抗Alexa Fluor 647标记的山羊抗兔IgG染色Perilipin，抗荧光衰减封片剂（含DAPI）封片。

1.3.4 CCK-8法检测细胞活力：取复温后的脂肪组织颗粒置于离心管中，加入等体积含有0.1%Ⅰ型胶原酶的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS），放入37℃水浴箱中振荡消化40min，终止消化后，将消化好的组织静置5min，待其分层后吸取上层的脂肪细胞于新的离心管中，使用PBS洗涤细胞，再次静置5min后，收集上层相对纯净的脂肪细胞，最后将脂肪细胞加入含10%胎牛血清的培养基中，调整细胞浓度，制备脂肪细胞悬液。以5 000个/孔的数量将脂肪细胞接种于96孔培养板，每孔体积200μl，培养板在培养箱预培养1h，之后向每孔加入20μl CCK-8溶液，继续放置培养箱内孵育，4h后取出，用酶联免疫检测仪测定在450nm处的吸光度（OD值）。

1.3.5 SVF细胞培养：取复温后的脂肪组织颗粒，经过胶原酶消化、过滤、离心等步骤后获得基质血管成分（stromal vascular fraction，SVF）[8]，之后将分离的SVF进行细胞培养，培養基每3d更换1次，原代培养14d后，观察培养瓶贴壁细胞的形态，并计数[9]。

1.4 统计学分析：以SPSS 17.0软件进行数据分析，结果以均数±标准差（x?±s）表示，采用单因素方差分析，SNK法进行两两比较的显著性检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1 自体脂肪组织颗粒大体形态观察：新鲜脂肪颗粒饱满有光泽，无液化油脂;随冻存时间的延长，复温后的脂肪组织颗粒形态逐渐下降、液化油脂杂质增多;冻存24周复温的脂肪组织中可见大量液化油脂，且破损颗粒多，脂肪细胞破坏严重。

2.2 组织学检测结果

2.2.1 不同冻存时间的脂肪组织颗粒的HE染色结果：新鲜脂肪组织颗粒的细胞形态良好，细胞膜及细胞间质清晰完整，细胞核大小一致，胞内脂滴溶解使细胞呈空泡样，细胞之间排列规律、紧密;冻存1周的脂肪组织颗粒，脂肪细胞结构较为清晰完整，光镜下与新鲜脂肪形态上无明显差异;冻存4、8、12、16、20、24周的脂肪组织颗粒，组织结构随冻存时间的延长越发紊乱，坏死结构增多，细胞膜变形、破裂，细胞核模糊不清。

2.2.2 不同冻存时间脂肪组织颗粒的免疫荧光染色结果：通过对新鲜及复温后的脂肪进行免疫荧光染色（脂肪：Perilipin、细胞核：DAPI），以评估脂肪细胞的活力。新鲜对照组中可观察到Perilipin强烈表达的脂肪细胞，而冻存脂肪的Perilipin阳性细胞数目明显减少，随冻存冻存时间的延长，脂肪细胞活性逐渐降低。计算Perilipin阳性区域面积，显示出：冻存1周的脂肪组织活细胞面积为（35.35±4.05）%较新鲜对照组（79.25±7.44）%显著减少，差异有统计学意义（P<0.01）;冻存4周的脂肪组织活细胞面积为（27.08±4.10）%较冻存1周的脂肪明显减少（P<0.05），其余各组脂肪每相邻两组间活细胞面积无显著性差异。

2.3 脂肪细胞线粒体活性检测结果：CCK-8结果显示，冻存1周的脂肪细胞较新鲜脂肪细胞活性显著下降，差异有统计学意义（P<0.01）;冻存4周的脂肪細胞较冻存1周的脂肪细胞活性明显下降（P<0.05），而其余各组脂肪每相邻两组间脂肪细胞线粒体活性无显著性差异。

2.4 SVF细胞培养：取新鲜、冻存1周、冻存24周的脂肪组织经过胶原酶消化、过滤、离心后获得SVF，通过SVF细胞培养获得贴壁细胞。新鲜脂肪来源的贴壁细胞数量多，细胞呈长梭形，形态完整均一，生长状态良好，冻存脂肪来源的贴壁细胞数量显著减少（P<0.01），冻存1周、冻存24周的脂肪组织获得的贴壁细胞数量无显著性差异;冻存培养过程中发现，细胞生长缓慢，形态非规则长梭形、多角，部分细胞呈羽状样并停止生长（红色箭头所示），这些细胞可能无活性或活性降低。

3  讨论

近年来，随脂肪抽吸及移植技术的不断优化，自体脂肪移植在整形外科临床治疗中被广泛应用。人自体脂肪不仅可作为填充材料用于改善软组织凹陷，其对面部年轻化、瘢痕等的治疗效果也逐渐得到了临床医生的肯定[10-11]。无论是从造福患者还是节约医疗资源的角度考虑，将一次抽吸的脂肪组织体外保存以供后续之用，是患者和医生共同的愿望和追求。

低温冻存是目前保存器官、组织或细胞最值得信赖的方法。近二十年来，众多学者为脂肪组织的低温保存已进行了大量的工作，包括优化脂肪组织的获取、添加冷冻保护剂、寻找更适应保存组织的温度、控制降温速率等，但目前并未形成一个完全标准统一的冷冻保存方案[12-15]。由于研究中的不确定因素较多，不同的研究人员在不同实验研究中得出了很多不甚相同的结果。在这样冷冻脂肪临床应用的安全性得不到保证的情况下，有不少个人和私立机构违规将脂肪组织直接保存于普通冰箱冷冻室，之后再度进行脂肪移植。这一不确定的治疗行为可能给患者带来了更大的术后并发症发生风险[16-17]。

本研究从临床角度出发，将人脂肪组织颗粒洗涤、离心后，不添加任何冷冻保护剂，保存于深低温冰箱（-80℃）中，冻存不同时间后观察复温后脂肪组织的细胞结构、活力、代谢改变，为冷冻脂肪的进一步优化以及标准化提供相关的基础实验依据。深低温冰箱（-80℃）及液氮（-196℃）的较普通家用冰箱（-20℃）更利于组织保存[18]，但由于液氮维护困难、稳定性较差不利于临床应用，故本实验选用了-80℃作为保存脂肪组织的实验条件。

从各项实验研究结果来看，随冻存时间的延长，脂肪组织的结构及生物学活性逐步下降。在冻存早期（1、4周），尽管大体外观和组织结构较新鲜脂肪变化不明显，但活脂肪细胞面积百分比及线粒体活性却呈现显著的下降趋势。只冷冻保存1周的脂肪，获得的贴壁细胞数量也显著低于新鲜脂肪，且生长状态较差。复合组织的冷冻过程是较单个细胞更为复杂的。在冻存早期，除细胞失水、胞内冰晶形成外，胞外冰的形成、血管损伤破裂、复温过程的热应力损伤对多细胞组织的低温保存也产生了很大的影响[19]。而这些损伤大多发生在降温、冻存早期及复温过程中。则可以认为，大多数脂肪细胞在一次冷冻保存过程中便失活，而冻存时间的延长与脂肪细胞活性降低的相关性并不明显。冷冻复温的脂肪组织可能更多是作为一种无活性或低活性的惰性材料植入体内。

本实验有一定的局限性，仅选择了单一的保存温度，且缺少相关的体内实验。将活性减低的冻存脂肪移植入体内是否会增加相关移植并发症的发生风险，需更进一步的研究。但就本实验结果而言，仍然不推荐临床使用不添加保护剂直接冻存的脂肪。期待日后有更优化的冷冻保存方法和革新技术，早日使冷冻脂肪广泛应用于临床。

[参考文献]

[1]Coleman SR.Structural fat grafts： the ideal filler？[J].Clin Plast Surg，2001，28（1）：111-119.

[2]Moscatello DK，Dougherty M，Narins RS，et al.Cryopreservation of human fat for soft tissue augmentation： viability requires use of cryoprotectant and controlled freezing and storage[J].Dermatol Surg，2005，31（11 Pt 2）：1506-1510.

[3]MacRae JW，Tholpady SS，Ogle RC，et al.Ex vivo fat graft preservation： effects and implications of cryopreservation[J].Ann Plast Surg，2004，52（3）：281-282，283.

[4]Zanata F，Bowles A，Frazier T，et al.Effect of cryopreservation on human adipose tissue and isolated stromal vascular  fraction cells： in vitro and in vivo analyses[J].Plast Reconstr Surg，2018，141（2）：232e-243e.

[5]孙音，伍明政，顾洛莎，等.人不同部位冻存颗粒脂肪活性的实验研究[J].中国美容整形外科杂志，2018，29（7）：417-420.

[6]邓颖，刘少倩，谢红炬，等.海藻糖对脂肪细胞冻存后存活率的影响[J].中南大学学报（医学版），2017，42（5）：507-510.

[7]Nishimura S，Manabe I，Nagasaki M，et al.Adipogenesis in obesity requires close interplay between differentiating adipocytes， stromal cells， and blood vessels[J].Diabetes，2007，56（6）：1517-1526.

[8]Yoshimura K，Shigeura T，Matsumoto D，et al.Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates[J].J Cell Physiol，2006，208（1）：64-76.

[9]Mashiko T，Wu SH，Kanayama K，et al.Biological properties and therapeutic value of cryopreserved fat tissue[J].Plast Reconstr Surg，2018，141（1）：104-115.

[10]Xu X，Lai L，Zhang X，et al.Autologous chyle fat grafting for the treatment of hypertrophic scars and scar-related conditions[J].Stem Cell Res Ther，2018，9（1）：64.

[11]王斐，陈敏亮，赖琳瑛，等.自体乳糜脂肪治疗增生性瘢痕的临床探究[J].中国美容医学，2017，26（12）：9-13.

[12]Cui X，Pu LL.The search for a useful method for the optimal cryopreservation of adipose aspirates： part Ⅱ.In vivo study[J].Aesthet Surg J，2010，30（3）：451-456.

[13]Cui X，Pu LL.The search for a useful method for the optimal cryopreservation of adipose aspirates： part Ⅰ.In vitro study[J].Aesthet Surg J，2009，29（3）：248-252.

[14]Cui XD，Gao DY，Fink BF，et al.Cryopreservation of human adipose tissues[J].Cryobiology，2007，55（3）：269-278.

[15]Pu LL，Cui X，Li J，et al.The fate of cryopreserved adipose aspirates after in vivo transplantation[J].Aesthet Surg J，2006，26（6）：653-661.

[16]Clover A，Buckley CE.Discussion： biological properties and therapeutic value of cryopreserved fat tissue[J].Plast Reconstr Surg，2018，141（1）：116-117.

[17]Chaput B，Orio J，Garrido I，et al.A clinical scalable cryopreservation method of adipose tissue for reconstructive  surgery assessed by stromal vascular fraction and mice studies[J].Plast Reconstr Surg，2014，133（4）：815-826.

[18]肖斌，劉毅，于晟，等.脂肪颗粒组织在不同冻存条件下低温保护剂的筛选[J].中国美容医学，2005，14（4）：397-399.

[19]Shu Z，Gao D，Pu LL.Update on cryopreservation of adipose tissue and adipose-derived stem cells[J].Clin Plast Surg，2015，42（2）：209-218.