高琳琳 宋 光

胃癌是最常见的胃肠道恶性肿瘤之一，也是全球癌症死亡的第二大致死因素[1]。据全国肿瘤登记中心统计数据显示，2015年中国癌症新增429.16万例，死亡281.42万例，其中胃癌67.91万例，在各类癌症中占比15.82%；因胃癌死亡49.8万例，在各类癌症中占比17.69%，居发生率和病死率的第2位[2]。胃癌是一种多种病因的复杂疾病，其病因包括幽门螺杆菌感染、遗传因素和某些环境饮食因素，比如食用含有致癌硝酸盐的腌制食品、生活方式、烟草、乙醇等。在影响胃癌发病的多种因素中，遗传易感性仍然是当前研究的热点。遗传易感性的不同主要来自于基因的多态性，其中单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是最常见的变异。SNP是决定人类疾病易感性的核心信息，它能够更加真实地体现不同人群个体之间的遗传差异，因此被认为是新一代的遗传标记。

肿瘤被认为是一种细胞周期性疾病，现已经证明细胞周期调控似乎在几种类型癌症的细胞增殖、分化和细胞凋亡中起关键作用，它可以影响线粒体代谢、通过DNA调节转录因子信号转导、染色体不稳定性的诱导等[3]。CyclinD家族(细胞周期蛋白)是细胞周期的正调节器，其中最重要的是细胞周期蛋白D1(Cyclin D1，CCND1)。CCND1贯穿了整个细胞周期，调节了细胞周期不同阶段的进展，在细胞周期中起到特定作用。它通过与周期素依赖性蛋白激酶4或6(CDK4或CDK6)结合形成复合体，并作为其调节亚基起作用，促进细胞从G1期进入S期，其活性是从G1向S期转变所必需的[4]。编码CCND1的基因,即CCND1基因,被称为原癌基因，它作为有丝分裂的信号传感器，通常在肿瘤细胞中的数量上发生改变，其基因扩增和蛋白质过度表达使细胞周期缩短，从而导致肿瘤细胞自主无限性增殖[5～7]。

CCND1基因存在多态性位点，即具有单核苷酸多态性，其中研究最多的是在核苷酸870(242位密码子)处的G/A多态性。许多研究表明，CCND1基因多态性与多种肿瘤有相关性，包括乳腺癌、结直肠癌等，但研究结果不尽相同，且与胃癌关系的研究较少[8，9]。因此，本研究采用病例对照研究，选取CCND1基因rs9344、rs7177、rs1944129多态性位点，探讨其与胃癌发生、发展的关系，为将来胃癌的早期诊断、筛查及治疗提供线索。

对象与方法

1.研究对象：收集2016年10月～2017年10月期间在哈尔滨医科大学附属第三医院就诊的胃癌患者292例(病例组)，所有患者均经临床和病理证实确诊为胃癌，均未进行过放疗和化疗，且为原发性胃癌，排除继发性或复发性肿瘤及其他恶性肿瘤。选取同期哈尔滨医科大学附属第一医院体检中心的健康体检者298例为对照组，既往均无肿瘤遗传病史，对照组与病例组患者的性别、年龄情况相匹配，两组人群无血缘关系。

2.方法：(1)血液基因组DNA提取:抽取研究对象外周静脉血2ml，采用天根生物技术有限公司提供的血液基因组DNA 提取试剂盒提取DNA，将提取的DNA于-20℃冰箱保存。(2)PCR扩增目的基因片段:根据CCND1基因组序列设计CCND1基因 rs9344、rs7177、rs1944129位点PCR引物。rs9344引物序列：上游引物:5′-GAACCTGAGGAGCCCCAACAAC-3′，下游引物:5′-GGCACTAGGTGTCTCCCCCTGT-3′。rs7177引物序列：上游引物：5′-AGGTGGACCTGGCTTGCACAC-3′，下游引物：5′-AAAACAACCAACAACAAGGAGAATGAA-3′。rs1944129引物序列：上游引物：5′-CCCCATTGGCTCATGCTAATTC-3′，下游引物：5′-GATTTATGGGGCCCGGAGCTAT-3′。PCR反应体系(20μl)包含1×HotStarTaq buffer, 3.0mmol/L Mg2+, 0.3mmol/L dNTP, 1 U HotStarTaq polymerase (Qiagen Inc.)，1 μl 样本DNA和1μl多重PCR引物。PCR扩增条件：95℃预变性5min后，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次，最后72℃10min，4℃保温。进行多重PCR产物纯化，用连接酶连接扩增产物。(3)DNA测序:取0.5μl 稀释后的连接产物，采用ABI3730XL测序仪进行测序。

结 果

1.两组一般资料比较：292例胃癌患者中，其中男性207例，女性85例；298例对照组人群中，其中男性203例，女性95例。病例组患者的平均年龄为56.93±10.19岁，对照组人群平均年龄为55.75±11.14岁。胃癌患者和对照组年龄和性别的比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，两组人群具有可比性，详见表1。

表1 两组一般资料比较

2.Hardy-Weinberg遗传平衡检验：经过Hardy-Weinberg遗传平衡检验，两组患者基因型的观察值和期望值比较，差异无统计学意义(P>0.05)，CCND1基因rs1944129、rs7177、rs9344位点基因型频率符合遗传平衡定律，所选样本具有代表性,详见表2。

表2 CCND1基因rs1944129、rs7177、rs9344位点基因型Hardy-Weinberg遗传平衡检验

3.CCND1基因rs1944129、rs7177、rs9344多态性与胃癌易感性的关系：病例组和对照组CCND1基因rs1944129、rs7177、rs9344位点的基因型频率，详见表3。结果显示，病例组与对照组比较，CCND1基因rs1944129、rs7177、rs9344位点基因型分布比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

表3 CCND1基因rs1944129、rs7177、rs9344多态性与胃癌易感性的关系[n(%)]

讨 论

胃癌是当今世界上最常见的危害全球人类健康的恶性肿瘤之一，当今社会经济和医疗水平逐步发展以及人类食物多样性大大增加，然而胃癌在全世界范围内发生率和病死率始终居高不下。胃癌的初期症状不甚明显，初期诊断率较低，多半患者自觉较重症状来医院就医时已经到了中期或晚期。胃癌的治疗手段包括手术治疗、化疗和放疗，虽然这些治疗措施显著提高了患者的生存率，但是预后仍较差，总体5年生存率仅为30%[10]。因此寻找到特异性生物标志物，可以帮助胃癌的早期诊断、筛查及药物靶向治疗等。目前有大量的研究证明遗传基因的多态性在胃癌的发生、发展进程中关联密切，其中SNP是能够作为新一代遗传学标记的突变形式。

CCND1 基因位于1lql3 染色体，包括5个外显子，4个内含子，长约15kb，编码细胞周期蛋白D1[11]。细胞周期蛋白D1是充当真核细胞周期的关键控制元件的蛋白质，它们的蛋白质水平在整个细胞周期中显著且周期性地改变。每个细胞周期蛋白表现出特征性表达和降解模式，这有助于有丝分裂事件的时间协调。细胞周期蛋白D1与CDK4或6结合，促进细胞从G1期向S期转化，其主要作用是能够磷酸化并灭活视网膜母细胞瘤蛋白(Rb蛋白)，因为Rb蛋白通过其抑制E2F转录活性的能力来抑制细胞周期进程[5]。在G1期，细胞需要做出决定是否进入另一个分裂，或者退出细胞周期进入静止期(G0)响应细胞外信号，细胞周期蛋白D1作为有丝分裂信号传感器，表现为对许多促有丝分裂信号的延迟早期反应，迫使细胞从G0期进入增殖周期。除了CDK依赖的功能之外，现在积累的大量证据表明，细胞周期蛋白D1也可以作为类固醇激素受体如雌激素受体的转录辅因子，除了肿瘤的形成，细胞周期蛋白D1还可以通过恶性细胞与宿主环境之间的相互作用在侵袭性和转移表型中起关键作用[11]。此外，细胞周期蛋白D1通常在血管生成和线粒体功能中起调节作用，这表明，细胞周期蛋白D1表达可能有助于肿瘤的侵袭性和转移潜能。

细胞周期蛋白D1在几种人类肿瘤中过度表达，其作用机制包括染色体易位、基因扩增和蛋白质水解的破坏等[11]。现在已经在公共SNP数据库(dbSNP)中鉴定并分类了超过250个跨越CCND1的SNP，其中CCND1G870A(rs9344)多态性位点在肿瘤中研究最多[12]。CCND1 870G/A(rs9344)SNP分为GG型、GA型和AA型，可以调节调节mRNA的剪接频率，其产生2个转录物，A等位基因产生转录物b，G等位基因产生转录物a，转录物编码具有功能性细胞周期蛋白盒的蛋白质(氨基酸55～161)。然而，转录物b缺少负责CCND1降解的PEST序列，这可能使转录物b编码的蛋白质比转录物a有更长的半衰期，因此具有CCND1 870A变体的个体更有可能绕过G1～S细胞周期检查点，从而导致癌症细胞异常增殖[13]。然而，也有研究表明G等位基因也可以产生转录物b，A等位基因也可以产生转录物a，这说明A等位基因可能不是转录物b生产的普遍需要。

Kuo等[14]通过对358例胃癌患者与358例健康者的研究中发现，CCND1rs9344位点多态性与胃癌风险相关，携带AG和GG基因型的受试者与CCND1rs9344上携带AA基因型的受试者相比具有较低的胃癌风险，因此CCND1 rs9344的AG和GG基因型可能是胃癌的早期发现和预测的保护性标志物。Kuo等[16]还调查了CCND1G870A基因型与个人吸烟状况对胃癌风险的相互作用，发现两者之间有协同作用，并可能增加台湾地区民众胃癌的风险。Tahara等[15]研究表明CCND1 G870A基因多态性与胃癌CpG岛启动子甲基化高风险相关联，这是第一份显示CCND1多态性与胃癌高甲基化状态之间潜在关联的报告。一项Meta分析评估了CCND1rs9344多态性与胃癌风险之间的关系，他们发现亚洲人群中CCND1rs9344多态性与胃癌发生之间无相关性，但可能增加高加索人的胃癌发病风险[16]。这表明基因多态性可能存在地域差异，可能与人群种族及生活方式的不同有关。

关于CCND1 rs7177位点多态性，有研究表明，它与肾癌、头颈部肿瘤等发病有关[3，17]。Petkevicius等[18]探究了欧洲人CCND1 rs7177 SNP与胃癌风险之间的关系，未发现两者之间的相关性，这与本研究结果是一致的。对于CCND1 rs1944129位点，Xue等[3]证实了其多态性与肾癌相关，但其与胃癌易感性之间的关系未见有相关报道。本研究探讨了CCND1 rs1944129位点多态性与胃癌的关系，结果显示：病例组中rs1944129位点基因CC型、CT型、TT型出现的频率分别为3.36%、35.57%、61.07%，对照组中基因型分别为5.14%、29.79%、65.07%，两组基因型差异无统计学意义(P>0.05)，研究结果表明rs1944129位点与胃癌的发生、发展可能无相关性。

本研究采用以医院为基础的病例对照研究，分析了CCND1基因rs9344、rs7177、rs1944129位点多态性与胃癌发病风险的关联。研究结果显示，CCND1基因rs9344、rs7177、rs1944129位点多态性与胃癌的发病风险均无明显相关性(P>0.05)。其原因可能是本研究样本量较小，在选择研究对象时有许多限制，这可能使相关性的统计效力存在一定的局限性，而且不能完全排除可能与特定基因型相关的受试者选择偏倚的可能性。另外，基因与环境等多种因素的相互作用、种族地域差异、个体的遗传异质性等也可能是其影响因素。CCND1基因多态性与胃癌易感性的关系尚需进一步验证，需要更大样本、大规模和精心设计的研究。