李浙峰 周光伟 王 峰 李 悦 徐 东 戴箴言

临床上组织瓣移植手术是解决组织缺损和创面长期不愈的有效方法。穿支皮瓣以符合“受区修复重建好，供区破坏损失小”的优点，广泛应用于临床，成为组织缺损修复技术的研究热点[1, 2]。穿支皮瓣仅以管径细小的皮肤穿动脉为蒂取瓣，故其供皮面积往往偏少，以三血管体为例，坏死常发生在潜在区，极大限制了穿支皮瓣的跨区切取。肉毒毒素(BTX)的应用在近十年发展迅速，以往研究发现BTX可以通过扩张血管改善皮瓣组织灌注，同时对皮瓣血管新生也起着重要的作用。而目前皮瓣领域研究较多的集中在A型肉毒毒素(BTX A)，对B型肉毒毒素(BTX B)近来也开始有所研究，BTX B与BTX A结构和功能相似，目前还没有相关报道将BTX B局部应用于choke Ⅱ区域以逆转跨区穿支皮瓣潜在区坏死的研究。本研究拟观察BTX B术中干预choke Ⅱ区对大鼠背部跨区穿支皮瓣成活的影响，并讨论其作用机制。

材料与方法

1.实验试剂及动物:B型肉毒毒素：(爱尔兰Elan制药公司)，红色氧化铅Pb3O4(中国上海试剂总厂)，RT-PCR试剂盒(美国Thermo公司)，SYBR Green I Master(美国Roche公司)，TRIzol(美国Invitrogen公司)。雄性健康SD大鼠50只，由温州医科大学实验动物中心提供，SPF级，实验动物许可证号：SCXK(浙)2005-0019，体重200～300g。

2.实验分组及模型制备：大鼠随机分为实验组(B型肉毒毒素组)和对照组(生理盐水组)，各25只。皮瓣掀起术后即刻，实验组在皮瓣choke Ⅱ区均匀皮下间隔0.2mm注射100U，总计1500U(约0.3ml)BTX B，对照组采用相同剂量生理盐水均匀注射choke Ⅱ区[3]。所有动物用戊巴比妥钠麻醉(30mg/kg，腹腔注射)，采用Yang等[4]大鼠皮瓣制作方法，在背部以后正中线为内侧缘，髂后上棘连线为下界，肩胛下角为上界，设计保留一侧髂腰深动脉穿支为蒂的背部三血管体穿支皮瓣，面积约为9cm×3cm皮瓣。切开皮瓣四周皮肤后，在深筋膜层面完全游离皮瓣，在皮瓣掀起后即刻，按上述方法注射BTX B或生理盐水，然后用4-0慕斯线，原位缝合(图1)。手术后1～3天，8万单位青霉素G腹腔注射，1次/天。

图1 切取以髂腰动脉穿支为蒂的跨区三血管体穿支皮瓣，将皮瓣原位缝合，choke Ⅰ及choke Ⅱ区中央区用苦味酸标记A.切取皮瓣;DCI.髂腰动脉穿支;IC.肋间后动脉穿支;TD.胸背动脉穿支;B.将皮瓣原位缝合

3.观察指标:(1)皮瓣观察及记录皮瓣成活:术后第7天麻醉下数码相机拍摄高质量图片，导入计算机图像软件(M2 Image Analysis System)计算皮瓣成活面积百分比，即皮瓣成活率。皮瓣坏死标准包括组织回缩、弹性差，质地坚硬，切割组织不出血。(2)明胶-氧化铅血管造影:分别于术后第7天取对照组、实验组各5只大鼠，采用明胶-氧化铅灌注法对大鼠行全身灌注血管造影。麻醉下将22-规格容量留置针置入大鼠颈总动脉，放血排尽大鼠体内血液，注入1%肝素1.5ml，用20ml注射器将配置好的20ml明胶-氧化铅混合物(含明胶1g、四氧化三铅20g、蒸馏水20ml)注入颈总动脉，直至大鼠巩膜及四肢末端显现出点状、斑片状红色。然后将灌注后标本置于4℃冰箱冷藏24h后，切取大鼠背部皮瓣，平铺行X线摄影。(3)实时荧光定量RT-PCR测VEGF、HIF-1α表达：术后第7天将大鼠处死，实验组、对照组各10只，取跨区穿支皮瓣choke Ⅱ区中央区域皮瓣组织。将切取的组织块(约100mg)置于1ml Trizol液中，采用生物匀浆机(Master Prep，MAK 6075-047 Hichuang bioer，中国)匀浆，按照Trizol法提取组织中总RNA，采用分光光度计检测RNA纯度及浓度(A260/A280>1.8)。根据浓度取1μg总RNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增。VEGF上游引物5′- CTGCTGTACCTCCACCATGC -3′，下游引物5′- CTGGCTTTGGTGAGGTTTGA -3′；HIF-1α上游引物5′- GATGGCTCCCTTTTTCAAGC- 3′，下游引物5′-TTTCTGCTGCCTTGTATGGG- 3′；β-actin上游引物5′- AGTTGAGGGGGACTTTCCCAGG -3′，下游引物5′- CCCTGGGAAAGTCCCCTCAACT -3′(由美国Invitrogen公司合成)。在无菌去酶的 Eppendorf 管中将配置好的 Real-time PCR反应液(反应总体积为 20μl)离心数秒，混匀后迅速置入Roche LightCycier®480 实时荧光定量 PCR仪中，采用两步法qRT-PCR扩增程序：Stage One预变性 95℃ 5min，Stage two95 ℃，10s，60℃ 10s，72℃ 10s，共45个循环，获得各样本待测基因的Ct值，采用ΔΔCt法进行试验数据处理,其结果代表目的基因表达的相对定量，以对照组作为矫正样本。(4)组织学检测:术后第7天取实验组、对照组各10只，切取跨区穿支皮瓣蒂部及choke Ⅱ区中央区域组织，面积约3cm×0.5cm，以10%甲醛溶液固定组织块，常规脱水包埋，制成3～4μm厚的切片并行HE染色。术后7天在10×10倍镜下在蒂部区域测量穿支动脉管径，管径=(最大横径+最大纵径)/2。于10×10倍视野下，在choke Ⅱ区中央区域找到微血管密集区，然后于20×10倍光镜下随意选取5个视野，计数血管数并取平均值，计算出单位面积微血管数(个/平方毫米)作为评价微血管密度(MVD)的指标。

结 果

1.皮瓣大体观察及成活率:术后第7天，两组皮瓣远端坏死部分均趋于融合，手感变硬，呈干性坏死，界线清晰(图2)。实验组和对照组背部皮瓣坏死率分别为90.0%±2.9%和75.0%±3.2%，实验组皮瓣的成活面积显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。

图2 术后7天大鼠背部三血管体穿支皮瓣的成活情况A.对照组;B.实验组

2.明胶-氧化铅照影:实验组各血管体区血管结构较为完整，choke Ⅰ及Ⅱ区血管结构清晰。在choke Ⅰ及Ⅱ区出现了大量的真性吻合(choke血管扩张)。远端坏死区域显示胸背动脉穿支入皮点以远仅部分紊乱或消失。对照组明胶-氧化铅造影示choke Ⅰ区、choke Ⅱ区的choke血管扩张不显著，第三血管体区血管结构较为紊乱，远端坏死区域显示胸背动脉穿支入皮点附近及远端血管结构紊乱或消失(图3)。

图3 大鼠背部三血管体皮瓣模型动脉造影A和B分别为实验组及对照组术后7天明胶-氧化铅动脉造影图。在choke区，实验组A较对照组B出现了大量的真性吻合(真性吻合为管径变粗的choke血管)

3.实时荧光定量RT-PCR测VEGF、HIF-1α mRNA表达：术后第7天，实验组VEGF、HIF-1α mRNA表达均较对照组有所提高。实验组choke Ⅱ区VEGF、HIF-1α mRNA表达量分别为2.10±0.56、1.98±0.33，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01，图4)。

图4 实时荧光定量RT-PCR测choke Ⅱ区的VEGF、HIF-1α mRNA表达实验组与对照组比较，差异有统计学意义；与对照组比较，*P<0.01

4.组织学检测:两组皮瓣蒂部区的组织形态无明显差异，实验组穿支动脉的管径较对照组明显增大(图5)。实验组穿支动脉管径及对照组穿支动脉管径分别为158.00±20.12μm、83.33±12.79μm，差异有统计学意义(P<0.01)。在choke Ⅱ区组织中，实验组及对照组微血管计数增多，分别为(43.36±9.11)个/平方毫米和(34.16±7.12)个/平方毫米，差异有统计学意义(P<0.05)。

图5 对照组与实验组皮瓣蒂部穿支动脉区组织HE染色(×100)A.对照组穿支动脉(a)及静脉(V)； B.实验组穿支动脉(a)及静脉(V)

讨 论

以往研究发现跨区穿支皮瓣坏死常常发生在潜在区，从而在根本上大大限制了跨区穿支皮瓣的扩大切取[5～8]。与此相反，动力学区往往都能成活，可能与 choke 区管径小、血流阻力大有关，当源动脉供应血流跨越动力学区至choke Ⅱ区时，减少的血流量已无法满足潜在区组织代谢及成活[9]。另一方面，血管新生历来被认为与皮瓣成活密切相关。国内外大量的研究显示血管新生参与了皮瓣的成活[10]。因此采取某种行之有效的方法使这3个不同供区之间的吻合血管开放、扩张乃至血管新生，进而通过新建的血液循环体系将3个不同的小供区变成一个大供区，可以提高跨区穿支皮瓣的成活率。

BTX由肉毒杆菌产生，属于多肽，从A至G，有7种血清型。BTX虽然有7种不同类型，但结构和功能相似。近来，越来越多的研究证明，BTX对血管有着不同程度的影响。首先BTX可以在神经肌肉连接处抑制乙酰胆碱的释放，通过化学去神经化作用于受交感神经系统支配的血管平滑肌细胞[11]。其次，BTX作用于Rho激酶，通过影响血管平滑肌细胞对钙离子的敏感度及NO系统直接抑制平滑肌细胞的收缩，从而使得血管扩张[12, 13]。另外，研究发现BTX A可以通过减弱自主神经释放去甲肾上腺素来抑制交感神经收缩血管[14]。因此，BTX可以通过扩张血管改善皮瓣组织灌注、氧携带量、代谢，最终提高皮瓣的成活率。Park等[3]报道吻合大鼠股动静脉术前3天将BTX B局部注射于股动脉周围，随后分别测量吻合前后股动静脉管径以及血流速度，发现经BTX B预处理后诱导了血管扩张，减少了血管阻力，因此血流速度得到明显增加，从而也有效地预防了血栓的形成。笔者的实验中，实验组中皮瓣choke Ⅰ及choke Ⅱ区choke血管真性吻合较明显多于对照组，从而改善了皮瓣远端的灌注。Arnold等[15]报道，将BTX A局部浸润1支三血管体皮瓣蒂部血管，结果并未明显提高皮瓣成活率及改善缺血区域，其分析原因可能是BTX A保护作用可能在远期，而本实验提示BTX B干预后皮瓣成活率明显增加，可能与BTX B在早期起效后通过扩张choke 血管改善了皮瓣血循环。

BTX对皮瓣血管新生也起着重要的作用。VEGF在改善皮瓣成活方面，是目前研究最为广泛且最为成功的生物因子[16]。它是缺氧组织在病理或者生理条件下释放的，是调节血管新生的关键因子[17]。Patel等[18]证实经BTX A局部注射预处理后的大鼠腹直肌(TRAM)皮瓣中，蒂部血管管径、VEGF、CD31均有明显提高。Kim等[19]同样也报道，经BTX A干预后的大鼠背部随意皮瓣组织中，血管管径增加,微血管数量明显增多，一些被认为与血管扩张及血管内皮细胞增生有关的生物分子，如VEGF、CD31及iNOS，含量也明显提高。随后，Park等[20]又报道了经BTX A术前预处理后的大鼠TRAM皮瓣组织中，CD34、VEGF、HIF-1α的含量均有明显提高，认为BTX A可能通过HIF-1α/VEGF通路改善了皮瓣血管新生，从而促进了TRAM皮瓣的成活率。VEGF是处于HIF-1α下游序列的靶基因，而HIF-1α是一种可以调节体内氧平衡和血管新生的转录因子，VEGF的上调作用可能来自HIF-1α[21]。笔者发现在实验组choke Ⅱ区，HIF-1α、VEGF的表达明显高于对照组，其可能原因是通过对HIF-1α的积累增加了 VEGF的表达，从而促进了choke Ⅱ区血管新生，进而促进了跨区穿支皮瓣的成活率，但其具体作用机制还有待进一步研究。

本实验同时发现实验组蒂部穿支血管第管径较对照组明显扩张，其原因可能正是由于通过choke 血管的扩张及choke Ⅱ的血管新生带动了整个皮瓣的血流量的增加，从而反馈性的扩张了蒂部穿支动脉的管径，但需进一步对血流量的改变进行研究。

综上所述，结合本实验数据结果及皮瓣成活情况，应用B型肉毒毒素术中干预choke Ⅱ区能有效地刺激大鼠背部跨区穿支皮瓣血管新生，扩张choke血管增加皮瓣远端的血流供应量，同时扩张了蒂部穿支动脉，从而降低了跨区穿支皮瓣潜在区的坏死率。