蔡清风 刘正敏 李 烨 胡小铭 刘补兴 童军卫

急性硬膜下血肿(acute subdural hematoma，ASDH)是由于大脑桥静脉断裂使得血液聚集于硬膜下腔而形成的一种颅脑损伤并发症，患者临床常出现颅内高压、脑水肿而表现为失语、偏瘫、昏迷等症状，其致残率高、病死率高，严重威胁患者生命健康[1]。研究发现，颅内高压、脑水肿多由非感染性炎性反应引起，而单核细胞趋化因子-1(MCP-1)、核因子-κB(NF-κB)在炎症发生过程中起着重要作用[2，3]。目前，临床多通过手术治疗ASDH患者，但手术病死率居高不下[4]。研究显示，中医药治疗ASDH能有效降低炎性反应，疗效显著[5]。由此，本研究通过建立成年大鼠ASDH模型，以探究分析豁痰化瘀利水方对ASDH大鼠脑组织MCP-1、NF-κB的影响，现报道如下。

材料与方法

1.材料与试剂：所有健康成年SD大鼠由笔者医院动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK(浙)2016-0019；豁痰化瘀利水方各中药成分均购自台州中医大药房；天丹通络胶囊(规格0.4克/粒；批号：20150204)购自山东凤凰制药股份有限公司；DAB显色试剂盒(规格：100ml，批号：DA1015)购自北京索莱宝科技有限公司；羊抗大鼠MCP-1(批号：sc-130328)及兔抗大鼠NF-κB多克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司；Trizol一步法试剂盒及RT-PCR定量引物均购自美国Invitrogen公司；RNA反转录试剂盒、RT-PCR试剂盒及相关酶类均购自日本TaKaRa公司；免疫印迹ECL发光试剂盒(规格：100ml，批号：E002050)购自上海硕嘉生物科技有限公司。

2.动物处理及分组：选取健康成年SD大鼠152只，雌雄各半，3月龄，体质量250±20g，按数字表法将其随机分为4组，每组各38只；(1)模型组：即ASDH组，钻孔注血，以灌胃方式给予该组2ml蒸馏水。(2)假手术组：即Sham组，只钻孔不注血，以灌胃方式给予该组2ml蒸馏水。(3)阳性对照组：以灌胃方式给予ASDH大鼠2ml天丹通络胶囊治疗，0.54g/kg，1次/天。(4)观察组：以灌胃方式该组给予ASDH大鼠2ml豁痰化瘀利水方低剂量、中剂量、高剂量治疗，浓度分别为14.13、28.26、56.52g/kg，1次/天；以上处理均持续14天。

3.药物制备：豁痰化瘀利水方由20g丹参、15g当归、15g川芍、15g水蛭、15g地龙、10g胆南星、6g天竺黄等中药材组成，加水600ml，室温浸泡30min，常规煎煮至200ml，过滤药液后并在药渣中重新加水300ml，常规煎煮至200ml，经再次过滤后弃渣保留滤液，合并2次过滤药液，将其加热浓缩，后续分别将其浓度稀释至实验所需浓度。将天丹通络胶囊药物活性成分研磨后溶于水中。

4.ASDH造模：依据Yokobori等[6]的造模方法，并稍加改良以复制ASDH模型，具体操作如下：所有SD大鼠均给予3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉后SD大鼠取俯卧位并将其头部固定于脑立体定向仪上，头部剃毛后给予常规消毒，沿头顶部正中线切开1个长约0.5cm的切口，偏右侧剥离骨膜以露出矢状缝与冠状缝，采用楔形高速钻头在矢状缝右侧3mm及冠状缝后侧2mm处开1个直径0.9mm的骨窗孔(注意避免破坏硬膜)，取自体股静脉血500μl通过骨窗孔以50μl/s的速度注入硬膜下腔隙(注意避免破坏蛛网膜)，待血液凝固后拔出针头，封闭骨窗孔并缝合头皮，连续3天注射青霉素以防止感染，通过剥离脑组织观察注血侧血肿情况已证实ASDH造模成功。

5.ASDH模型脑组织血肿观察：处理14天后，每组随机取8只大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛进行麻醉，完全麻醉后切断大鼠头颅，迅速剥离脑组织观察各组血肿大小，以ASDH造模后第3天大鼠脑组织血肿面积为对照1(即100%)，分析各组处理后急性硬膜下血肿消散情况。

6.脑组织免疫组化分析：处理14天后，每组随机取8只大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛进行麻醉，完全麻醉后切断大鼠头颅，取注血侧脑组织于液氮中冷冻10s，之后用冰冻组织切片包埋剂(OTC)包埋脑组织，通过冰冻切片机获得4μm厚的冠状位连续切片，将脑组织切片置于10%甲醛溶液于4℃下固定过夜，经脱蜡、脱水等处理后，可通过DAB显色试剂盒进行MCP-1、NF-κB免疫组织化学染色。阳性细胞表达为棕黄色，在光学显微镜下每只大鼠脑切片随机选取5个不连续视野(放大倍数×400)，依据视野中阳性细胞表达比例表示该切片MCP-1、NF-κB的表达情况。

7.脑组织MCP-1及NF-κB mRNA水平检测：处理14天后，每组随机取8只大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛进行麻醉，完全麻醉后切断大鼠头颅，取注血侧脑组织100mg，采用Trizol一步法试剂盒提取大鼠脑组织总RNA，保证总RNA的浓度、纯度及完整性，通过RNA反转录试剂盒获取模板cDNA，将模板稀释至100ng/μl，采用RT-PCR试剂盒分别以MCP-1、NF-κB及内参基因β-actin定量引物(引物序列见表1)，在RT-PCR仪上(厂家：Bio-Rad；型号：CFX96)进行实时荧光定量PCR(RT-PCR)，反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s；55℃退火25s；72℃延伸20s，40个循环；72℃延伸5min。数据读取由实时荧光定量PCR仪自动完成，供试基因的扩增效率均在85%以上。基因MCP-1、NF-κB及β-actin表达水平计算采用2-ΔΔCt方法，详见表1。

8. 脑组织MCP-1及NF-κB蛋白水平检测：处理14天后，每组随机取8只大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛进行麻醉，完全麻醉后切断大鼠头颅，从注血侧脑组织中提取总蛋白。将脑组织用1×PBS缓冲液漂洗2次，之后置于含1mmol/L PMSF的RIPA细胞裂解液中进行匀浆，经低温离心机以12000r/min转速离心10min后分离上清液，加入2×PBS上样缓冲液，经沸水浴变性10min，通过10%的SD-PAGE 凝胶电泳分离蛋白，将分离蛋白转移至PVDF膜，经5%脱脂奶粉于4℃下封闭1h，并用一抗兔抗大鼠MCP-1、NF-κB及β-Actin多克隆抗体以1∶500比例于4℃下孵育过夜，之后再将HPP结合的二抗以1∶5000比例与膜于室温下孵育1h，通过免疫印迹ECL发光试剂盒检测大鼠脑组织MCP-1、NF-κB蛋白表达水平。

表1 基因MCP-1及NF-κB引物序列

结 果

1.急性硬膜下血肿消散情况比较：与ASDH模型组比较，其余各组血肿面积均显著降低，详见表2。低剂量组大鼠脑组织血肿消散改善情况低于阳性对照组(P<0.01)，中、高剂量组均高于阳性对照组(P<0.01)，且高剂量组显著高于中剂量组(P<0.01)。对各脑组织组血肿面积定量分析发现，与ASDH模型组比较，各组血肿面积均显著降低(P<0.01)，详见图1、图2；低剂量组明显高于阳性对照组

表2 不同组急性硬膜下血肿面积比较

与ASDH模型组比较，*P<0.01；与阳性对照组比较，#P<0.01；与低剂量组比较，ΔP<0.01；与中剂量组比较，▲P<0.01

(P<0.01)，中、高剂量组血肿面积显著低于阳性对照组(P<0.01)，且高剂量组低于中剂量组(P<0.01)，详见图3。

图1 不同组急性硬膜下血肿消散情况

图2 不同组血肿消散情况

图3 不同组血肿面积比较与ASDH模型组比较，*P<0.01；与阳性对照组比较，#P<0.01；与低剂量组比较，ΔP<0.01；与中剂量组比较，▲P<0.01

2.免疫组化分析：各组中均观察到脑组织细胞质中MCP-1、NF-κB蛋白阳性表达，Sham组MCP-1、NF-κB蛋白有弱阳性表达，而ASDH模型组MCP-1、NF-κB蛋白强阳性表达，详见表3、图4及图6。与ASDH模型组比较，其他组阳性细胞表达均显著降低(P<0.01；与阳性对照组比较，观察组中剂量、高剂量组阳性细胞表达显著降低(P<0.01)，而低剂量组阳性细胞表达显著升高(P<0.01)；与中剂量比较，高剂量组阳性细胞表达显著降低(P<0.01)，详见表3、图5及图7。

表3 不同组阳性细胞表达情况比较

与ASDH模型组比较，*P<0.01；与Sham组比较，#P<0.01；与阳性对照组比较，ΔP<0.01；与低剂量组比较，▲P<0.01；与中剂量比较，&P<0.01

图4 MCP-1蛋白表达染色情况

图5 MCP-1阳性细胞表达比例与ASDH模型组比较，*P<0.01；与Sham组比较，#P<0.01；与阳性对照组比较，ΔP<0.01；与低剂量组比较，▲P<0.01；与中剂量组比较，&P<0.01

图6 NF-κB蛋白表达染色情况

图7 NF-κB阳性细胞表达比例与ASDH模型组比较，*P<0.01；与Sham组比较，#P<0.01；与阳性对照组比较，ΔP<0.01；与低剂量组比较，▲P<0.01；与中剂量组比较，&P<0.01

3.MCP-1及NF-κB mRNA水平：各组总RNA提取琼脂糖凝胶电泳图，详见图8；与ASDH模型组比较，其他组MCP-1、NF-κB mRNA相对表达水平均显著降低(P<0.01)；与阳性对照组比较，中剂量、高剂量组MCP-1、NF-κB mRNA相对表达水平均显著降低(P<0.01)，低剂量组水平均显著升高(P<0.01)；与中剂量比较，高剂量组MCP-1、NF-κB mRNA相对表达水平均显著降低(P<0.01)，详见表4、图9及图10。

与ASDH模型组比较，*P<0.01；与Sham组比较，#P<0.01；与阳性对照组比较，ΔP<0.01；与低剂量组比较，▲P<0.01；与中剂量组比较，&P<0.01

图8 各组总RNA琼脂糖凝胶电泳

图9 MCP-1 mRNA相对表达水平，以ASDH模型表达水平为对照与ASDH模型组比较，*P<0.01；与Sham组比较，#P<0.01；与阳性对照组比较，ΔP<0.01；与低剂量组比较，▲P<0.01；与中剂量组比较，&P<0.01

图10 NF-κB mRNA相对表达水平，以ASDH模型表达水平为对照与ASDH模型组比较，*P<0.01；与Sham组比较，#P<0.01；与阳性对照组比较，ΔP<0.01；与低剂量组比较，▲P<0.01；与中剂量组比较，&P<0.01

4.MCP-1及NF-κB蛋白水平：各组蛋白电泳图见图11。与ASDH模型组比较，其他组MCP-1、NF-κB mRNA相对表达水平均显著降低(P<0.01)；与阳性对照组比较，中、高剂量组MCP-1、NF-κB蛋白相对表达水平均显著降低(P<0.01)，而低剂量组均显著升高(P<0.01)；与中剂量比较，高剂量组MCP-1、NF-κB mRNA相对表达水平均显著降低(P<0.01)，详见表5、图12及13。

表5 不同组MCP-1、NF-κB蛋白相对表达水平

与ASDH模型组比较，*P<0.01；与Sham组比较，#P<0.01；与阳性对照组比较，ΔP<0.01；与低剂量组比较，▲P<0.01；与中剂量组比较，&P<0.01

图11 MCP-1、NF-κB蛋白免疫印迹电泳条带

图12 MCP-1蛋白相对表达水平，以β-actin内参蛋白为对照与ASDH模型组比较，*P<0.01；与Sham组比较，#P<0.01；与阳性对照组比较，ΔP<0.01；与低剂量组比较，▲P<0.01；与中剂量组比较，&P<0.01

图13 NF-κB蛋白相对表达水平，以β-actin内参蛋白为对照与ASDH模型组比较，*P<0.01；与Sham组比较，#P<0.01；与阳性对照组比较，ΔP<0.01；与低剂量组比较，▲P<0.01；与中剂量组比较，&P<0.01

讨 论

本研究基于Yokobori等[6]的造模方法并加以改良后获得了稳定、高效的大鼠急性硬膜下血肿模型(ASDH)，通过剥离脑组织观察注血侧血肿情况已证实ASDH造模成功。为确定正常情况及治疗处理后血肿消散情况，本研究分析统计各组血肿面积，结果表明正常情况下ASDH模型14天后存在部分血肿自然消散情况，而其他组血肿面积均显著低于ASDH模型组；处理后观察组中剂量及高剂量组血肿面积均显著低于阳性对照组，而观察组低剂量组血肿面积显著高于阳性对照组，提示豁痰化瘀利水方具有促进血脑屏障恢复，减轻脑水肿的作用，且与剂量有关，剂量越高其效果越显著。

有关研究表明，急性硬膜下血肿发生后，其血肿周围组织可刺激诱导多种炎性细胞因子聚集，并引发机体炎性反应，进而加剧脑损伤[7，8]。MCP-1属于CC趋化因子家族，是一种促炎细胞因子，可在神经元细胞、神经胶质细胞等的神经组织中表达，脑血肿损伤能够特异性激活并趋化单核-吞噬细胞参与炎性反应，而活化的神经胶质细胞可产生大量神经毒性因子，在脑损伤、神经炎症等多种疾病中具有重要作用[9，10]；MCP-1可通过单核-吞噬细胞浸润诱导释放炎性细胞因子及在脑损伤区域聚集白细胞而加剧血肿炎性反应[11]。研究显示，ASDH等疾病发生时MCP-1水平呈高表达，病情好转时，MCP-水平显著降低[12]。本研究结果表明，与ASDH模型组比较，其他组血肿面积、MCP-1阳性细胞表达比例、mRNA相对表达水平及蛋白水平均显著降低，且效果与豁痰化瘀利水方剂量呈依赖关系，认为豁痰化瘀利水方更能有效减少硬膜下血肿面积，豁痰化瘀利水方可能通过抑制织MCP-1表达，抑制炎性通路活化，减轻炎性反应，减轻脑水肿，并促进血肿的消散。此结果与有关研究一致，进一步表明豁痰化瘀利水方对改善ASDH具有一定的作用。

NF-κB是一种核转录调控因子，经刺激活化后能够调控多种细胞因子、趋化因子等蛋白合成，并促使释放大量炎性细胞因子，参与ASDH引起的炎性反应网络，产生的炎性瀑布反应可进一步引起继发性脑损伤[13]；NF-κB在脑损伤中同时具有双重作用，可促进炎性反应引起神经损伤，同时对神经系统起到保护作用[14]。还有研究认为，NF-κB是调节脑损伤后炎性反应的重要靶点，其不仅可介导多种炎性因子的表达，也是调节脑损伤后炎性反应的重要信号调控因子[15,16]。有关研究认为，化瘀涤痰汤对急性硬膜下血肿大鼠脑组织NF-κB介导的炎性反应具有调节作用，且对ASDH大鼠也有明显的治疗作用[16]。

本研究结果显示，不同组 NF-κB mRNA及蛋白水平比较差异有统计学意义，随着豁痰化瘀利水方剂量升高， NF-κB mRNA及蛋白水平呈现下降的趋势，且效果与剂量呈依赖关系，表明NF-κB与ASDH的发生密切相关，而豁痰化瘀利水方能够通过降低NF-κB的表达而达到改善ASDH，推测其作用可能是通过调节NF-κB的平衡而实现的。可能是本方剂中含有丹参、当归、水蛭等药物，丹参能够抑制NF-κB的表达与活性，使多种炎性因子基因转录减少，减少炎性递质释放，缓解炎性因子损伤及氧化应激反应；而当归具有增强免疫力、抗炎、清除自由基、抗血栓形成及改善血液循环等作用，当归能够降低氧化自由基对NF-κB的活化引起的炎性反应，诸药合用对ASDH发挥较好的改善作用。

综上所述，豁痰化瘀利水方能够有效减少急性硬膜下血肿面积，降低脑组织中MCP-1、NF-κB的表达，其效果与豁痰化瘀利水方剂量关系密切，值得后期进一步扩大样本量、增加脑损伤指标等进行深入研究，以期为急性硬膜下血肿患者的治疗提供一定参考依据。