刘文华 陶潞渊 徐恩国

心房颤动(以下简称房颤)是指心房以无规则、快序、紊乱的颤动波取代了规则有序的电活动，导致心房失去了有效的收缩功能，是临床上最严重的心房电活动紊乱[1，2]。非瓣膜性房颤是房颤的重点，其所占比例明显高于瓣膜性房颤[3]。非瓣膜性房颤易导致心房血液淤滞，易形成血栓，血栓并发急性心肌梗死是非瓣膜性房颤最大的危害。我国每年约有 170 万人因非瓣膜性房颤并发急性心肌梗死而入院，其30 天再发心肌梗死率为8%～10%，心力衰竭发生率为15%～30%，病死率为6%～8%[4,5]。微小RNA(microRNA，miRNA)能调控转录水平后的基因翻译，其机制为结合信使RNA的3′端非翻译区进行调控，此外胚胎的发育、细胞增殖与分化均与miRNA关系密切[6，7]。miR-150低表达还可致使血管内皮严重损伤，激活凝血反应链，导致纤维蛋白及免疫球蛋白也应激增高，形成高凝状态和纤溶亢进，终致血液黏滞性及凝固性增加而处于高凝状态或血栓前状态，进一步诱发心房颤动及心力衰竭的产生[8，9]。在急性心肌炎、类风湿关节炎、骨关节炎中，miR-486表达降低，提示miR-486在此类疾病中发挥重要调控作用[10]。本研究拟探讨非瓣膜病房颤患者患者血清miR-486和miR-150水平其临床诊断价值，并与传统的非瓣膜病房颤评价指标左心房内径(left atrial diameter，LAD)及左心室射血分数(left ventricular ejection fraction ，LVEF)为非瓣膜病房颤的早期诊断及治疗提供理论及实践基础。

资料与方法

1.一般资料：选取2015年10月～2017年11月在笔者医院心血管内科确诊的非瓣膜病房颤患者80例为病例组，经临床表现、实验室检查(血常规、血生化)及心电图、冠脉造影诊断确诊, 符合2013 年《美国心房颤动管理治疗指南》[11]诊断标准(心房颤动是一种室上性快速心律失常，出现不协调的心房激动并导致心房收缩无效), 且心电图特诊包括规则有序的 P 波消失R-R 间期不规则，代以不规则的心房颤动波。选择同时期于笔者医院门诊健康体检者76例作为对照组，对照组均无既往肺栓塞病史、恶性肿瘤、6周内手术史、下肢外伤史、心功能不全、脑血管意外、长期卧床史。对照组76例，其中，男性36例，女性40例，患者年龄46～70岁，平均年龄58.7±12.7岁。均签署知情同意书。纳入标准：患者 LDL-C水平超过 100mg/dl；既往有短暂脑缺血发作或缺血性卒中或体循环动脉栓塞史；初中以上文化水平；控制良好的轻、中度高血压(血压≤160/100mmHg)。本研究经笔者医院医学伦理委员会审批；所有患者(或患者直系亲属)均签署知情同意书。排除标准：可逆性因素所致非瓣膜病房；孕妇或近3个月有手术、创伤史；冠心病以外的其他心脏病、心功能不全，合并未控制的严重高血压、瓣膜性心脏病以及急诊冠状动脉介入治疗者。终止、退出标准：患者依从性差；出现严重不良事件及其他原因致使继续试验困难。

2.主要仪器及试剂：贝克曼AU-480全自动生化分析仪(美国库尔特公司)、S2000心脏彩色超声多普勒分析仪(德国西门子公司)、Trizol试剂(美国Invitrogen公司)，反转录试剂盒及实时荧光定量PCR试剂盒(碧云天生物技术公司产品)、miR-486、miR-150基因的表达测定采用UltraSYBR One Step RNA PCR Kit(宝生物工程大连有限公司)、实时荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司)、NanoDrop2000c 型蛋白核酸检测仪(美国Thermo公司)、恒温培养箱grp-9080(美国通用公司)、超净工作台(上海恒跃医疗器械有限公司)。 TG、HDL-C、LDL-C试剂盒为AU-480全自动生化分析仪原厂自带试剂。

3.方法：S2000心脏彩色超声多普勒分析仪测定病例组及对照组患者LAD、LVEF(%)。同时病例组及对照组患者清晨空腹及肱静脉抽血；取静脉血10ml置于无菌管中，室温静置30min，3000r/min离心,10min，分离血清，贝克曼AU-480全自动生化分析仪测定甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol ，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol ，LDL-C)，剩余血清用于测定miR-486、miR-150基因的表达，参照GenBank 数据获取 2 个基因多态性位点的序列，设计待测基因位点的PCR 扩增引物和单碱基延伸引物，按20μl 模板和 50μl 反应液构成 PCR 反应体系， 扩增程序:95℃ 5min; 93℃10s，61℃ 30s，重复 40个循环，61℃ 时采集荧光(表1)，RT-PCR反应体系为：2×超级赛博一步法 RT-qPCR 缓冲液5μl，正向引物(10μmol/L) 0.4μl，反向引物(10μmol/L)0.4μl，超级酶混合物0.2μl，RNA模板0.6μl，去核糖核酸酶水3.4μl。实时荧光定量 PCR 仪检测其表达量。

表1 miR-486、miR-150引物序列

结 果

1.两组一般情况比较：由表2可见，两组在性别、年龄、BMI、吸烟、冠心病、糖尿病、饮酒、高血压、高脂血症等一般资料比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 两组一般情况比较

2.两组miR-486、miR-150指标比较：由表3可见，病例组miR-486、miR-150表达水平低于对照组，差异有统计学意义(t=17.54、19.02，P<0.05)。

表3 两组miR-486、miR-150指标比较

与对照组比较，*P<0.05

3.两组血脂指标比较：由表4可见，病例组HDL-C水平低于对照组，TG、LDL-C水平高于对照组，差异有统计学意义(t=17.43、18.13、20.16，P<0.05)。

表4 两组血脂指标比较

与对照组比较，*P<0.05

4.两组LAD、 LVEF常规评价指标比较：由表5可见，病例组LAD水平高于对照组，LVEF水平低于对照组，差异有统计学意义(t=17.43、20.42，P<0.05)。

表5 两组LAD、 LVEF常规评价指标比较

与对照组比较，*P<0.05

5.miR-486、miR-150与各指标相关性分析：由表6可见，miR-486、miR-150与TG、HDL-C、LDL-C、LAD呈负相关，与LVEF呈正相关，差异有统计学意义(R=-0.541、-0.567、-0.569、-0.624、-0.498、-0.501、-0.566、-0.594，0.644、0.587，P<0.05)。

6.各指标诊断非瓣膜病心房颤动的价值分析：由表7可见，诊断非瓣膜病心房颤动时，miR-486、miR-150的AUC与LVEF相近，差异无统计学意义(Z=1.65、1.52，P>0.05), miR-486、miR-150的AUC均高于LAD 、TG、HDL-C、LDL-C，差异有统计学意义(Z=14.67、13.57、15.32、11.78、13.41、15.78、12.14、13.98，P<0.05)。

表6 miR-486、miR-150与各指标相关性分析

表7 各指标诊断非瓣膜病心房颤动的价值分析

讨 论

miRNA是在线虫体内发现的一种具有高度进化保守性的非编码小 RNA。作为较早发现的一种 miRNA，其在调控细胞的基因表达方面有极其重要的作用，同时在肿瘤的发生、发展中也扮演者重要的角色[12]。经典的miRNA作用途径是通过碱基互补配对与靶信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)的3’端非编码区特异性结合抑制miRNA的翻译。

研究发现miR-486蛋白可介导细胞的定向转移和趋化性，并激活淋巴细胞、内皮细胞、中性粒细胞、上皮细胞上相应的趋化因子受体[13]。miR-486在调节人体细胞的复制、遗传物质脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)损伤修复、以及炎性细胞的产生、转移等方面有重要作用。遗传基因学发现miR-486过表达是引发大部分自身性炎性反应的主要原因，高度表达miR-150蛋白的淋巴细胞株增殖能力明显高于野生株[14]。miR-486 mRNA除了具有经典的miRNA作用方式，还存在非经典的miRNA作用方式，即与靶mRNA的结合方式：miR-486 mRNA与靶mRNA的5′端结合可发挥转录后抑制的作用；一项研究表明，下调miR-486可能导致钙调素依赖性蛋白激酶对兰尼碱受体2在 S2814 位点的过度磷酸化，其机制与miR-486抑制蛋白磷酸酶2(protein phosphatase 2,PP2A )调节亚单位 B56α有关，进而促使肌质网内的钙离子大量释放，心肌细胞内钙循环稳态失衡，心肌兴奋-收缩耦联增强，兰尼碱受体2钙离子通道的活性加强，导致房颤发生[15]。Forman等发现let-7a可作用于Dicer酶mRNA的编码区，抑制Dicer酶的表达。白细胞介素-8、血管内皮生长因子由可能由miR-486调控，低表达miR-486蛋白的淋巴细胞可分泌更多的白细胞介素-8、血管内皮生长因子，而白细胞介素-8、血管内皮生长因子在供应炎症的形成过程中发挥重要作用。此外miR-486还可致使血管内皮严重损伤，胶原组织暴露，组织因子释放，刺激血小板附着和聚集，从而激活凝血反应链，导致纤维蛋白及免疫球蛋白也应激增高，形成高凝状态和纤溶亢进，终致血液黏滞性及凝固性增加而处于高凝状态或血栓前状态，进一步诱发房颤[16]。

miR-150可通过阻断蛋白激酶 B信号通路抑制心血管内皮细胞增殖和集落形成，在急性心肌炎、类风湿关节炎、骨关节炎中，miR-150表达降低，提示miR-150在此类疾病中发挥重要调控作用[17]。miR-150通过调控钾离子通道及钙离子水平来影响心肌细胞的电生理活动。miR-150靶向作用于 PP2A 的催化和调节亚基并抑制其表达，引起舒张期 Ca2+峰及后除极发生改变，导致 Ca2+/Ca MKⅡ依赖性兰尼碱受体2在S2814 位点和S2030 位点的磷酸化增加，容易诱发室性心律失常[18]。miR-150通过各种多功能蛋白、生长因子信号、受体分子等参与细胞内周期进程的调控，并对细胞 DNA 的复制起始和增殖起到十分重要的作用。研究表明miR-150与胚胎的发育有关，能直接下调Nodal蛋白家族中的squint蛋白，还能调控Nodal蛋白的抑制剂letfy[19]。

本研究结果显示，病例组miR-486、miR-150表达水平低于对照组，差异有统计学意义；病例组HDL-C水平低于对照组，TG、LDL-C水平高于对照组，差异有统计学意义；病例组LAD水平高于对照组，LVEF水平低于对照组，差异有统计学意义；miR-486、miR-150与TG、HDL-C、LDL-C、LAD负相关关系明显，与LVEF呈正相关，差异有统计学意义，说明非瓣膜病房颤患者血清中miR-486、miR-150水平降低，且miR-486、miR-150与TG、HDL-C、LDL-C、LAD呈负相关，与LVEF呈正相关，诊断非瓣膜病房颤时，miR-486、miR-150的AUC与LVEF相近，差异无统计学意义,miR-486、miR-150的AUC均高于LAD 、TG、HDL-C、LDL-C，差异有统计学意义，则说明miR-486、miR-150诊断非瓣膜病房颤的AUC与LVEF相近，适合在临床上推广应用。

综上所述，非瓣膜病房颤患者血清中miR-486、miR-150水平降低，且miR-486、miR-150与TG、HDL-C、LDL-C、LAD呈负相关，与LVEF呈正相关，miR-486、miR-150诊断非瓣膜病房颤的AUC与LVEF相近，适合在临床上推广应用。