梁丽丽 吕娅敏 马 芸 刘 新 孙书贞 张国龙

我国是世界上结核病负担最重的6个国家之一，仅次于印度、印度尼西亚。2010年我国第5次结核病流行病学抽样调查显示,15岁及以上人口中活动性肺结核患病率为459/10万，患者高达499万(471万～527万)，涂阳肺结核患者有72万(58万～86万)[1]。2015年全球估计共有1040万例新发结核病例。在这1040万新发病例中，检出和正式通报病例仅有610万例，遗漏病例高达430万例。结核病早期诊断仍是全球面临的重大挑战[2]。快速、准确、及时地诊断结核病成为控制结核病疫情的关键。

近年来发展起来的γ-干扰素释放试验(interferon gamma release assays,IGRAs)为结核病的诊断提供了新途径，它是用产生γ-干扰素(IFN-γ)的T淋巴细胞是否对结核分枝杆菌特异性抗原有记忆，来判断机体是否感染过结核分枝杆菌。国内外研究表明IGRAs对活动性结核病诊断的综合敏感度为85%～90%，综合特异性为85%～97%[3，4]。IGRAs检测方法目前常用的试剂盒包括QuantiFERON-TB Gold test(QFT)、酶联免疫斑点法(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)和结核分枝杆菌感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)，其中T-SPOT.TB被认为是检测T淋巴细胞反应敏感度和特异性最高的方法，其检测仅需采集5～6ml静脉血，体外培育24h即可得到结果[5]。虽然T-SPOT.TB对活动结核病的诊断有很高的特异性，但其作为一种体外结核病诊断方法，仍不能完全排除假阴性。目前对于T-SPOT.TB假阴性检测结果进行深入分析的研究并不多见,故本研究拟通过分析224例T-SPOT.TB结果为阴性的活动性结核病患者的临床资料，并与同期收治的253例T-SPOT.TB结果为阳性的活动性结核患者进行比较，以期寻找与T-SPOT.TB结果假阴性结果相关的独立影响因素，进而为今后临床的辅助诊断提供一定的思路。

对象与方法

1.对象：回顾性分析2016年1月～2017年9月河南省胸科医院和河南省人民医院诊治的、临床或实验室诊断为活动性结核病的初治患者1760例。纳入标准依据WHO的结核病诊断标准，其中确诊活动性结核病的标准为：痰/其他标本TB-DNA阳性者或培养结果为结核杆菌[6]；临床诊断为活动性结核病的标准为：临床表现和影像学表现支持结核，且抗结核治疗有效。根据T-SPOT.TB检测结果分为两组，即阴性组224例，阳性组1536例。为减少实验室误差及两组因两组样本量差别大引起的统计学偏差，最终选择同天入组的477例进行统计学分析。阴性组224例，其中男性151例，女性73例，患者年龄11～89岁，中位年龄为50岁。TB-DNA阳性或结核菌培养阳性的患者148例，临床诊断结核76例。阳性组253例，其中男性157例，女性96例，患者年龄8～89岁，中位年龄为36岁。TB-DNA阳性或结核菌培养阳性的患者186例，临床诊断67例。所有病例人免疫缺陷病毒(HIV)检测均为阴性，无妊娠或免疫抑制剂用药史。

2.T-SPOT.TB检测：所有患者均在抗结核治疗前行T-SPOT.TB检测，采用T-SPOT.TB试剂盒(英国Oxford Immunotech公司，批号：TEC053921) 并严格按照试剂盒说明书进行。采集静脉血4～6ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离出外周血单个核细胞(PBMC)，将浓度调整为2.5×106/ml的细胞悬液。每例测试样本需要4个检测孔：无血清的细胞培养液作为阴性对照，植物血凝素(PHA)作为阳性对照，特异性抗原ESAT-6和CFP-10作为刺激抗原，每孔加入100μl细胞悬液(即每孔加入的细胞数为25万个)，将培养板放在含有37℃，5%CO2，湿度适中的的培养箱中孵育16～20h。加入酶标二抗后再于2～8℃孵育1h，洗板后每孔加50μl显色液室温避光反应7min，蒸馏水终止反应，干燥后使用显微镜进行斑点计数。并按照说明书的判读标准进行结果判定。

3.统计学方法：首先对回顾性研究结果进行单因素Logistic回归分析，选取差异有统计学意义和临床意义的因素再进行多因素的Logistic回归分析，最后确定与T-SPOT.TB结果假阴性相关的独立影响因素。以P<0.05为差异有统计学意义。用调整的比值比(OR) 及95% 的可信区间(CI) 估计各因素与T-SPOT.TB结果假阴性的联系强度。

结 果

1.临床病例情况：在224例T-SPOT.TB阴性组结核病患者中，肺外结核4例(淋巴结结核4例)，肺结核207例(肺组织结核134例，结核性胸膜炎10例，肺组织结核合并气管结核33例，肺组织结核合并胸膜结核30例)，肺结核合并肺外结核患者13例(肺结核合并淋巴结结核3例，肺结核合并胸壁结核10例)。在253例阳性组结核病患者中，肺外结核5例(淋巴结结核5例)，肺结核219例(肺组织结核169例，结核性胸膜炎20例，肺组织结核合并气管结核16例，肺组织结核合并胸膜结核11例，肺组织结核合并气管、胸膜结核3例)，肺结核合并肺外结核29例(肺结核合并结核性腹膜炎7例，肺结核合并胸壁结核5例，肺结核合并淋巴结结核5例，肺结核合并结核性脑膜脑炎5例，肺结核合并骨关节结核4例，肺结核合并腹腔、骨关节结核1例，肺结核合并腹腔、肠结核2例)。两组患者的基本资料见表1。

2.单因素Logistic回归分析:变量赋值表见表2。采用单因素Logistic分析分别研究各指标与假阴性的相关性，结果显示年龄(OR=1.046，95% CI：1.034～1.059)、淋巴细胞计数(OR=0.231，95% CI：0.162～0.330)、单核细胞计数(OR=0.281，95% CI：0.162～0.488)对假阴性的影响可能存在统计学意义(P<0.05)。淋巴细胞计数、单核细胞计数是假阴性的保护因素，淋巴细胞计数、单核细胞计数越高，发生假阴性的可能性越低。年龄是假阴性的危险因素，年龄每增加1岁，假阴性的风险增加0.046倍。性别、ESR、WBC等其他因素对假阴性的影响无统计学意义。单因素Logistic回归分析T-SPOT.TB假阴性结果的危险因素见表3。

表1 两组患者基本资料

3.多因素Logistic回归分析：为了消除混杂因素的干扰，同时剔除掉单因素分析中无统计学意义的性别因素，进一步分析各危险因素之间的真实效应。以是否假阴性为因变量，单因素分析中差异有统计学意义的年龄、淋巴细胞计数、单核细胞计数为自变量，进行二元Logistic逐步回归分析，纳入和排除标准为0.05和0.10。患者年龄(OR=1.045，95% CI：1.031～1.059)、淋巴细胞计数(OR=0.242，95% CI：0.164～0.356)、单核细胞计数(OR=0.254，95% CI：0.134～0.480), 可以认为年龄、淋巴细胞计数、单核细胞计数是假阴性的独立影响因素(表4)。患者年龄每增加1岁，出现假阴性的独立风险增加0.045倍，淋巴细胞计数每升高1×109/L，出现假阴性的独立风险降低0.242倍，单核细胞计数每升高1×109/L，出现假阴性的独立风险降低0.254倍。

表2 多因素Logistic回归分析变量赋值表

表3 T-SPOT.TB结果假阴性危险因素的单因素Logistic回归分析

表4 T-SPOT.TB结果假阴性影响因素的多因素Logistic回归分析

讨 论

目前诊断结核病的方法主要有涂片染色法、结核菌培养法、分子基因生物学方法等，但这些检查都需要有足够量的标本才能进行。而临床工作中很多情况下无法获得充足的标本，成为了制约结核病诊断的瓶颈。IGRAs由于只需血液标本就能进行检测，在缺少标本导致无法进行病原学检测时，可作为活动性结核的辅助诊断方法，尤其对于肺外结核的诊断有很大意义。国内外研究表明IGRAs对活动性结核病诊断的敏感度为85%(95% CI: 84%～86%)，特异性为84%(95% CI:83%～85%)，与本研究中T-SPOT.TB诊断活动性结核病的敏感度(87.3%,1536/1760)相似[3,6]。

IGRAs检测阴性结果表示尽管对照抗原刺激后T细胞分泌正常，但结核分枝杆菌特异性抗原刺激后IFN-γ产生不足或不产生。理论上表明受试者体内没有结核分枝杆菌特异性抗原致敏的T淋巴细胞，也就代表受试者未感染结核分枝杆菌。因为有部分假阴性结果的存在，在临床工作中常导致结核诊断的延误和错判。

结核分枝杆菌感染人体后，细胞免疫开始发挥作用。巨噬细胞分泌MHCⅡ类抗原递呈并与有αβ-T细胞受体的未定型CD4Th细胞前体结合，巨噬细胞分泌的IL-12促进幼稚型CD4T淋巴细胞分化为Th1细胞，后者分泌IFN-γ。在此过程的任一细胞出现功能减低，都会造成IFN-γ分泌减少，从而出现假阴性结果。以往文献报道，T-SPOT.TB虽然有很高的阴性预测值,但实际上其检测结果可能会受到药物(环氧化酶抑制剂、T细胞活化抑制剂)、HLA分型等影响[7～10]。

本研究发现，对于结核患者，224例假阴性组病例的患者平均年龄为50岁，显著高于253例阳性组病例的患者平均年龄36岁。曾有文献证实随着年龄的增长，免疫细胞逐渐减少，导致抗体免疫力逐渐下降，对结核抗原的应答能力也趋于下降[11]。而肺结核的小鼠模型也发现，年长小鼠和年轻小鼠的辅助T1淋巴细胞(Th1)数量有差别，且老年小鼠抗原特异性CD4+T细胞免疫功能受损[12]。Liao等[13]曾报道在合并HIV阳性的结核患者中，其IGRAs结果不确定或结果阴性，可能与T细胞丝裂原反应被抑制有关。本研究证实年龄的增长是T-SPOT.TB结果出现假阴性的独立影响因素，与Hang等[9]和Azghay等[14]报道一致。

本研究中，假阴性组患者的外周血淋巴细胞计数明显低于阳性组患者，其原因可能为：T淋巴细胞在宿主对结核分枝杆菌感染的免疫应答中起关键作用，Th1细胞分泌IFN-γ参与细胞介导的特异性免疫应答，且对MTB感染的保护性免疫更依赖于T淋巴细胞的反应。淋巴细胞的减少，使宿主对结核抗原缺乏应答。动物实验也证实：缺乏T淋巴细胞的猕猴，或感染了猴免疫缺陷病毒(SIV)的猕猴，显示出对活动性结核或结核再感染的易感性增加[15～17]。正因为淋巴细胞减少，且对结核抗原的应答下降，使结核分枝杆菌特异性抗原刺激后T淋巴细胞分泌IFN-γ不足或不产生，从而使T-SPOT.TB出现假阴性的结果。

在结核分枝杆菌侵入人体后，宿主产生的细胞免疫反应中单核-吞噬细胞是抗原递呈细胞和主要的抗菌效应细胞。单核细胞是结核感染免疫的重要起始和效应细胞，在吞噬抗原后将所携带的抗原决定簇转交给淋巴细胞，诱导淋巴细胞产生特异性免疫反应。而单核细胞减少，必将导致抗原递呈降低从而使幼稚型CD4T淋巴细胞分化为Th1细胞减少，引起IFN-γ分泌不足或不产生。本研究发现，较低数目的单核细胞是产生T-SPOT.TB假阴性结果的独立影响因素。

在单因素回归分析中，本研究发现合并糖尿病不是T-SPOT.TB假阴性结果的影响因素。但Faurholt-Jepsen等[18]曾报道，糖尿病与结核分枝杆菌特异性IFN-γ水平下降有关，空腹血糖越高，结核分枝杆菌特异性IFN-γ水平越低。而Walsh等[19]也报道，T-SPOT.TB检测的敏感度不会因患者合并糖尿病而降低。本研究的回归分析发现空腹血糖升高并不是导致T-SPOT.TB出现假阴性结果的独立影响因素。笔者认为，出现不同结论也许与合并糖尿病的结核患者是否应用降糖药物，是否血糖得到控制有关。在本研究中，假阴性组40%(16/40)患者未经过降糖药物治疗，其空腹血糖超过10.0mmol/L，其余假阴性组60%合并糖尿病的结核患者已经过降糖药物治疗。Tan等[20]也曾观察到，在血糖控制良好的糖尿病合并结核患者，T-SPOT.TB检测的阴性预测值明显高于血糖控制不佳的患者。

在本研究中，两组病例在结核病史、是否合并肺外结核及是否合并糖尿病等合并症上未有明显差异，且两组病例在红细胞沉降率、C反应蛋白等指标中未出现差异，与以往文献报道不同[21]。可能与患者处于疾病不同阶段有关,红细胞沉降率和C反应蛋白均是反应感染的指标，而Azghay等[14]认为合并细菌感染会使IGRAs结果呈假阴性。但因条件所限，本研究并未进一步观察PPD硬结直径与T-SPOT.TB结果之间的关系，也未观察到重症、轻症结核患者对T-SPOT.TB结果的影响，还需今后开展更全面的临床研究加以阐明。

综上所述，对于疑似结核的老年患者，或淋巴细胞降低、单核细胞降低的疑似结核患者，即使T-SPOT.TB结果为阴性，也应结合临床，判断是否为细胞免疫功能低下导致的T-SPOT.TB结果为假阴性，避免因假阴性结果延误诊断及治疗。