邵 拓，胡宇航，张轩硕，沈洪涛，于占革

(哈尔滨医科大学附属第一医院脊柱外科,哈尔滨 150001)

下腰痛作为现代社会最常见的疾患之一，已严重影响人们的工作和生活。病因学研究显示，椎间盘退变及其继发的病变是产生疼痛的主要原因[1]。对椎间盘退变疾病的治疗方法目前仅局限于保守治疗及外科手术干预等对症治疗，尚无有效的早期干预和延缓退变进程的方法。因此，为了寻找良好的治疗方式，探究其疾病发生的分子机制成为研究热点。微RNA(microRNA，miRNA)是一类短序列的RNA，主要通过作用于目标RNA，降解或阻遏信使RNA的翻译，使靶基因在细胞中差异性表达，进而调控下游通路的激活。随着对miRNA研究的深入，椎间盘退变的分子机制得到了更详尽的阐述。已有众多研究报道miRNA在神经退行性疾病、骨关节退行性疾病中均发挥重要作用[2-3]，甚至可以成为调控肿瘤疾病进程的靶点[4]，这种miRNA的肿瘤治疗技术也已进入临床审核阶段。提示应用miRNA的可行性，研究者希望将此种疗法应用于椎间盘退变的领域，并进行了大量研究，现对miRNA在椎间盘退变中的作用进行综述，同时指明进一步向临床成果转化的方向。

1 miRNA调控髓核退变的分子机制

基因芯片对比研究发现，一些miRNA在退变的髓核细胞中的表达与正常髓核细胞中存在显著差异，这些差异表达的miRNA通过调控其各自的上下游通路可能参与髓核细胞退变的进程，调控通路多有交叉并行，构建出一个庞大的miRNA调控网。而这些miRNA的作用多遵循已发现的几种髓核退变机制学说(表1)。

PI3K/AKT：磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B；casepase-3：胱天蛋白酶-3；MAPK：促分裂原活化的蛋白激酶；HOXA：同源异型盒A家族；ATG：自噬相关基因；PDCD：细胞程序性死亡因子；AP：核转录激活蛋白；PTEN:人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因；IL：白细胞介素；pERK：蛋白激酶R样内质网激酶；cyclin：细胞周期蛋白；SOX：SRY相关同源盒；GDF：生长分化因子；MMP：基质金属蛋白酶；Chsy：硫酸软骨素糖基转移酶；TRAF：肿瘤坏死因子受体相关因子；↑：上调；↓：下调；-：未知

1.1 调控髓核细胞凋亡、增殖 凋亡增殖学说认为，髓核的凋亡导致椎间盘组织中髓核细胞的数量的减少，因此难以维持间盘结构和功能，进而导致间盘退变[5]。但在退变早期，为了补充丢失的细胞，髓核细胞发生异常增殖进行自我修复[6]。当增殖难以补充凋亡，发生失代偿时，椎间盘退变程度将不断加剧。因此，抑制髓核细胞的凋亡，并促进髓核细胞增殖可能延缓椎间盘的退变进程。

在对髓核退变相关miRNA的研究发现，大多miRNA在退变的髓核中呈高表达，且对凋亡起促进作用。如miR-210、miR-328-5p、miR-589-3p可以通过Fas通路、受体型酪氨酸蛋白激酶通路等促进髓核细胞凋亡[7-9]。在另一方面，miR-125a、miR-129-5p等抑制髓核凋亡和自噬过程[10-11]，研究者还发现某些 miRNA，如miR-96可以促进髓核细胞的增殖[12]。证明在髓核退变过程中，同时存在髓核细胞的凋亡和增殖，且随着退变程度增加，凋亡和增殖也愈加活跃，相关miRNA的表达量也随之增加或降低。而通过外源性调控以上这些miRNA的表达，可以间接增加髓核细胞增殖、减少凋亡，延缓椎间盘退变的进程。不过，也有研究显示，损伤模型的髓核细胞中miR-27a的表达上调，而进一步通过表达载体上调miR-27a时，却引起磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路介导的凋亡减少[13]。这与以往的“凋亡等于退变”或“凋亡程度等于退变程度”的观点不同，提示，在髓核退变进程中，髓核细胞凋亡和自我保护性增殖的触发或许都存在一个最低临界点和最高峰值。但这种理论还需更多研究证实，而目前的退变凋亡学说仍存在缺陷，需要进一步的完善和补充。

1.2 通过基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)家族调控细胞外基质稳态失衡 细胞外基质的稳态失衡也是椎间盘退变的机制。细胞外基质中主要含有MMP、崩解素、含凝血酶基序的金属蛋白酶等分解因子，以及Ⅱ型胶原、糖苷类物质等合成因子。正常情况下，分解与合成同时存在，互相形成稳态，当有外界因素影响时，分解因子增加而合成因子减少，造成了稳态失衡，髓核静水压力下降，使脊柱的压缩载荷无法平均分布，最终导致椎间盘退变[14]。

对比退变髓核与正常髓核进行基因芯片发现，差异表达的miRNA多数通过调控MMP蛋白家族发挥作用。如miR-132、miR-133a、miR-127-5p、miR-155、miR-210、miR-663b等，可通过其不同靶基因，最终作用于MMP-16、MMP-9、MMP-13、MMP-3、MMP-2来调控细胞外基质的稳态平衡，使之趋向于分解[15-20]。除miR-155和miR-663b为负向调控外，其余均为正向调控[20-21]。通过干扰RNA抑制这些miRNA的表达可减少MMP的合成，减少细胞外基质的分解，达到减缓间盘退变的效果。

针对miRNA的研究为将MMP作为调控髓核退变的目标靶点提供了可行性证据，由于MMP具备酶的高效性，调控MMP的合成可最大化miRNA对细胞外基质的调控效应，为调控众多MMP的功能提供了统一化解决模式，同时也巩固了细胞外基质稳态学说的地位。

1.3 调控炎症因子的分泌 研究者认为，开始发生退变的髓核细胞会与免疫系统细胞一同分泌炎症因子，如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1α/β、白细胞介素-6和白细胞介素-17等，这些炎症因子具有促进髓核退变的作用[22]。miR-21和miR-27的上调都会增加炎症因子的分泌[23-24]，而上调miR-146a却可以通过肿瘤坏死因子受体相关因子/核因子κB通路来减少退变髓核细胞中炎症因子的分泌[25]。说明通过调控miRNA来减少髓核细胞分泌炎症因子可行，但以上miRNA能否对免疫细胞的分泌产生调控作用尚待研究。

2 miRNA多向调控退变机制

人们曾假设椎间盘退变的上述3种机制(细胞增殖凋亡、细胞外基质稳态及炎症反应)是互相联系，互相促进的。凋亡的髓核细胞引起炎症反应使免疫细胞趋化，进而使细胞外基质分解因子增加，分解产物进一步促进退化的椎间盘释放趋化因子。趋化因子促进T细胞、B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞激活并浸润退变的椎间盘组织，进一步放大炎症级联反应，促进髓核细胞的凋亡，导致椎间盘退变加速[26]。这形成了一个恶性循环，使髓核愈加退变，仅切断其中一环难以完全阻遏此循环，但miRNA及其靶点具有多向调控功能，使同时调控多机制成为可能。

同一个miRNA可同时调控髓核细胞异常凋亡增殖和细胞外基质稳态两种机制(如miR-210,miR-589-3p等)，miRNA的过表达会同时促进髓核细胞凋亡和MMP分解Ⅱ型胶原，加快髓核退变[8,20]。除此之外，过表达miR-27或miR-21会在促进炎症因子释放的同时促进髓核细胞的异常增殖或凋亡[13,23-24]。当miRNA受干扰后，相应的凋亡增殖、基质稳态、炎症因子释放均得到抑制。miRNA的调控不仅具有多向性，还具有归一性，虽然miRNA作用于不同的靶基因(P-p38、pERK1/2、GDF5)，但通过激活促分裂原活化的蛋白激酶通路，最终表现为炎症因子的释放量和MMP的生成量的同向增加或减少[15,24]。

miRNA加强了上述3种机制间的联系，并在此基础上，构建了一个复杂的分子调控关系网，现今所探知的miRNA及其通路之间的互相作用关系只是其中一小部分，研究此关系网中的“枢纽”调控点将对未来选择miRNA上下游调控的起点和靶点具有指导作用。同时，还有一部分miRNA的调控功能独立于以上几种主流机制之外，如抑制miR-194、miR-515会阻遏其靶基因硫酸软骨素糖基转移酶1/2/3 mRNA的翻译，中断下游硫酸软骨素糖基转移酶的合成，阻碍硫酸软骨素的生成，使椎间盘细胞的生物骨架的稳定性减弱，降低了椎间盘的负重强度、黏弹性等，从而促进椎间盘退变[27]。还有研究表明，髓核退变与血管长入相关，正常的髓核细胞能够抑制血管内皮细胞增殖，而退变的髓核抑制效果降低[28]，使miR-21调控的血管内皮的增殖和迁移增加[29]，促使微血管长入髓核，破坏了椎间盘内微环境。以上关于miRNA的研究，增加了研究者对椎间盘退变机制的认知，对于发现新的分子机制具有重要引导意义。

3 miRNA在髓核退变中的应用

3.1 退变模型的构建

3.1.1 细胞水平退变模型构建 现阶段研究者对于有关髓核退变的miRNA研究多停留于细胞水平，但研究人员采用的退变髓核样本不尽相同，导致实验结果不存在可比性。同是对于miR-21在髓核退变中作用的实验研究，腰椎间盘突出患者术中摘除的自然退变髓核细胞中miR-21的表达量较正常对照组显著增高[30]，而在肿瘤坏死因子-α诱导退变的髓核细胞模型中，miR-21的表达量却显著低于正常对照组[31]，产生了完全相悖的结论。原因可能是体外建模的退变髓核细胞多处于退变前期，与已经达到手术指征的患者样本相比退变程度差异显著。对于细胞水平的髓核退变程度，学者们多通过免疫荧光测定细胞内Ⅱ型胶原含量予以衡量[20-22]，但目前尚缺乏统一性标准。体外促髓核细胞退变模型尚不能完全模拟体内的自然退变水平，仍需进一步改进。

3.1.2 动物水平髓核退变模型构建 尽管众多学者对miRNA调控椎间盘退变的分子机制及其调控靶点已解释得较为清楚，但这些研究却大多局限于细胞水平，miRNA在椎间盘退变中的体内应用效果鲜有报道。报道过的动物的椎间盘退变模型构建方法主要包括：①利用特殊动物沙鼠的自发性椎间盘退变模型[32]；②改变椎间盘力学环境的退变模型；③穿刺或穿刺抽吸髓核构建的退变模型；④化学损伤造成的椎间盘退变动物模型；⑤基因敲除技术构建的椎间盘退变模型[33]。这几种方式各有其利弊，但综合伦理学及可重复性和经济因素，应用最广的为椎间盘穿刺或穿刺髓核抽吸法。椎间盘穿刺法需要构建的时间较长(约4周)，椎间盘穿刺髓核抽吸法所需时间较短(约2周)，经磁共振成像及病理学切片验证均可产生良好的诱发间盘退变效果[34]。所用动物多为大鼠或新西兰大白兔，动物的性别可能是影响结果的变量之一，在研究中均给予控制。但在针对人的miRNA的研究中发现，性别并非是影响miRNA表达量的因素[35]。雄性大鼠的椎间盘穿刺模型是现在应用较广泛的椎间盘退变建模方案。

3.2 临床应用可行性及安全性 在椎间盘内注射富集miRNA的间充质干细胞外泌体是已在小鼠体内证实的可行miRNA体内给药方式，可充分发挥miRNA的延缓髓核退变功能[31]。除直接间盘注射外，将富集miRNA的外泌体经皮穿刺椎弓根给药或许是另一种体内给药方式，因为有研究表明骨髓间充质细胞外泌体可以通过终板软骨屏障[36]。诸如静脉注射的其他给药方式，虽在肿瘤治疗方面取得一定成果，但在椎间盘退变领域尚无成功案例。

miRNA的多调控性在抑制髓核细胞凋亡的同时也可能会引起肿瘤细胞的增殖和迁移[37]，以及加速阿尔茨海默病的发展[38]。这可能会限制miRNA在同时患有恶性疾病及阿尔茨海默病的椎间盘退变疾病患者中的应用。为了了解miRNA在椎间盘退变患者中应用的安全性，有必要进一步验证其剂量对其他疾病发生发展的影响。同时，有研究表明，在椎间盘退变的患者中，外周血的miRNA表达量与正常人群存在显著差异[39]。因此，在miRNA局部椎间盘内给药后测定静脉血中的miRNA水平可能也是验证miRNA在体内应用的安全性的方法之一。

4 结 语

miRNA因具有多调控性、构建简单的特点，被认为是未来延缓和治疗髓核退变的重要靶点。在髓核细胞异常增殖和凋亡、调控细胞基质外稳态平衡以及调控髓核细胞炎症反应因子的分泌中均发挥重要的作用，但由于数量庞大，作用复杂，探究几种机制的共调控miRNA是未来研究的重点。

在今后进行miRNA与髓核退变的研究时，应采用患者术中摘取的髓核进行实验，以避免细胞建模造成的退变程度不一致影响实验结果。同时，由于miRNA具有促肿瘤细胞生长迁移作用，在治疗椎间盘退变的体内研究中，探究给药方式、剂量和安全性是进一步临床应用的前提。如果有条件，对外周血中的miRNA表达量也应加以定量。富集miRNA间充质干细胞外泌体椎间盘注射在椎间盘退变的临床治疗上已初见成效，或成为未来miRNA体内给药的主要途径。综上所述，miRNA对椎间盘退变疾病治疗的应用前景不可估量。