王康馨，赵 阳，闫 婧综述，刘宝瑞审校

0 引 言

放射治疗与手术、化疗是肿瘤三大传统治疗手段，放疗在直接杀伤肿瘤细胞的同时，可释放肿瘤相关抗原及一系列免疫刺激信号，激活细胞毒性T细胞来杀伤肿瘤细胞，同时还能产生“远隔效应”消除一些非照射区恶性转移的肿瘤细胞［1］。然而，放疗也会诱导抗原调变和免疫抑制分子上调，使肿瘤细胞免疫原性减弱，T细胞失能、耗竭，最终导致免疫逃逸和免疫耐受的发生［2］。临床观察放射治疗不敏感的患者，由免疫逃逸引起的肿瘤复发与转移仍然是导致死亡的主要原因，这种现象表明单一放疗的免疫激活能力仍存在局限性［3］。因此，需要联合免疫治疗进一步增强放疗诱导的免疫效应。近年来随着免疫学研究的不断深入，鉴定和抑制免疫逃逸的关键驱动因素——免疫检查点，可能会重新激活抗肿瘤免疫反应，从而改善患者预后［4］。本文就肿瘤放疗的免疫调节特性及其联合免疫检查点阻断治疗的应用现状与研究进展作一综述，旨在为这一联合治疗模式的临床实践提供参考。

1 肿瘤放疗的免疫调节特性

放射治疗利用高能射线杀伤肿瘤，其通过释放活性氧介导DNA损伤和内质网应激，最终导致这些受损细胞阻滞于正常的有丝分裂周期，以凋亡、坏死、衰老等形式进入细胞死亡阶段［5-6］。除电离辐射直接作用于靶区的杀伤效应外，非靶向的系统性免疫反应也被激活，免疫系统一方面促进机体抗肿瘤，另一方面诱导肿瘤细胞形成免疫耐受，在肿瘤发生发展中扮演着“双刃剑”的角色［7］。放射治疗的免疫调节特性主要体现在以下四个方面［6］：①动员并激活肿瘤抗原特异性T细胞，通过释放三磷酸腺苷、钙网蛋白、高迁移率族蛋白B1等危险信号以及干扰素、补体裂解片段C3a/C5a等免疫调节因子［8］，这些信号分子共同促进树突状细胞成熟与抗原提呈，动员并激活肿瘤抗原特异性T细胞；②增加淋巴细胞浸润肿瘤实质，放疗可促进血管结构正常化、增加内皮细胞表面黏附分子的表达，使淋巴细胞从血管中迁徙、有效浸润至肿瘤实质，同时诱导CXCL16等趋化因子的释放进一步招募T细胞［9］；③重塑肿瘤免疫微环境，一方面，放疗促进肿瘤微环境基质中CD11b+髓系来源的细胞表面抗原释放和提呈，诱导肿瘤特异性免疫反应来消除这些免疫抑制的基质成分，调节负性肿瘤微环境［10］；④调节肿瘤细胞的免疫表型，放疗通过增加肿瘤细胞表面MHC I及Ⅱ类分子、应激配体、死亡受体的表达来上调T细胞及NK细胞的杀伤敏感性［11］。然而，放疗也会激活肿瘤细胞释放多种免疫抑制因子，如集落刺激因子、转化生长因子-β等，并招募髓系抑制细胞、Foxp3+调节性T细胞（T regulatory cells，Tregs）等免疫抑制细胞，共同抑制抗肿瘤免疫反应［12-13］；与此同时，放疗还会引起肿瘤表面程序性死亡配体-1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）上调，使其免疫原性减弱，并且与T细胞表面程序性死亡蛋白-1（programmed cell death-1，PD-1）分子结合后触发抑制性信号通路使T细胞失能、凋亡［14］。因此，放疗对免疫系统的影响是一个动态而复杂的过程，放疗通过内源或外源性途径动员效应T细胞至肿瘤组织发挥杀伤效应，与此同时也募集了一些髓系抑制细胞的浸润，而免疫活化后分泌释放的细胞因子诱导肿瘤细胞表型改变，进一步影响抗肿瘤免疫反应。

2 放疗联合免疫检查点阻断剂的治疗策略

免疫检查点是一种T细胞上的免疫抑制分子，通过与相应配体/受体结合抑制机体的抗肿瘤免疫反应。经典的免疫检查点主要包括细胞毒T淋巴细胞抗原-4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4，CTLA-4）、PD-1，二者分别在T细胞活化初始与效应阶段抑制T细胞杀伤肿瘤的功能［15］。免疫检查点阻断剂有助于改善肿瘤局部微环境，促进T细胞功能的恢复，从而解除机体对肿瘤的免疫耐受。目前大量研究表明放疗联合免疫检查点阻断剂具有协同抗肿瘤作用，联合治疗有利于肿瘤抗原提呈和T细胞活化，全面激活机体免疫应答，较单一治疗方式具有更广泛及持久的抗肿瘤功效［16-17］。

2.1 联合治疗提高肿瘤局部控制率Demaria等［18］首次报道了一项局部放疗联合抗CTLA-4抗体9H10治疗4T1乳腺癌多发转移灶的动物实验研究，结果显示联合治疗组较单独治疗组的抗肿瘤效应明显增强、生存期明显延长，且同期肺部转移灶的数目减少。随后另有基于TSA乳腺癌、MCA38结肠癌、GL261胶质瘤动物模型的研究，均显示放疗和抗CTLA-4/PD-1抗体同步治疗时，可有效激活以CD8+T细胞为主的免疫反应，且联合治疗使得肿瘤局部浸润淋巴细胞数目和γ-干扰素（+）肿瘤特异性T细胞的比例升高，肿瘤局部控制率明显提升，表现为联合治疗组小鼠肿瘤病灶缩小以及生存期延长，而单独治疗组无明显生存获益［19］。基于上述临床前研究的结果，放疗联合免疫检查点阻断剂的临床试验也已在黑色素瘤、肺癌以及前列腺癌等多种类型肿瘤中陆续开展并取得了显著的疗效［20-23］。

2.2 联合治疗激活机体免疫应答诱发“远隔效应”“远隔效应”即在肿瘤局部放疗时引起非照射区远位转移病灶缩小的现象。研究表明，放疗通过促进肿瘤相关抗原的释放、激活免疫应激信号通路，从而促进抗原特异性T细胞向非照射转移灶趋化并杀伤肿瘤细胞［24］。然而，单独放疗引起的“远隔效应”在临床上较为少见，究其原因，一方面由于患者自身肿瘤经抗原调变后，抗原丢失，免疫原性减弱，另一方面则由于多数晚期肿瘤患者体内的免疫抑制微环境限制效应T细胞对肿瘤细胞的杀伤［25］。而联合免疫检查点阻断剂有助于改善肿瘤局部微环境，促进T细胞功能的恢复，从而解除机体对肿瘤的免疫耐受。

有研究构建乳腺癌、结肠癌双侧皮下荷瘤小鼠模型，原位肿瘤接受外照射，第二肿瘤模拟转移灶不接受外照射，经放疗联合抗CTLA-4抗体治疗后非照射区肿瘤病灶生长缓慢，且在介导远隔效应上常规分割放疗优于单次大剂量分割照射［26］。Deng等［14］利用TUBO乳腺癌小鼠模型行单次大分割放疗联合抗PD-1抗体治疗后也观察到了免疫介导的远隔效应，并通过肿瘤再负荷实验发现，联合治疗组小鼠在再次荷瘤时仍能产生记忆性的免疫应答，体现了联合治疗不仅能够激活全身性的抗肿瘤免疫反应引起远处转移灶的消退，也有助于体内记忆性T细胞的储存。临床个案报道显示1名行Ipilimumab治疗后疾病进展的转移性黑色素瘤患者，予脊髓转移灶姑息性放疗1个月后，脊髓病灶及其他病灶均未见缩小，后继续予Ipilimumab治疗1个月后发现脊髓及其他病灶均明显缩小［27］。在随后进行的放疗联合Ipilimumab治疗转移性黑色素瘤的Ⅰ期临床试验中，18%的患者放疗野外肿瘤获得了部分缓解，18%的患者维持稳定［22］。尽管联合治疗介导的远隔效应有一定临床预见性，但目前的报道多限于转移性黑色素瘤、结直肠癌等肿瘤类型，并且能够激活系统免疫引起远隔效应的放疗剂量以及分割模式尚无定论，因此，未来的研究需要对不同瘤种及具体的放疗参数作出进一步解答。

2.3 联合治疗克服常规分割放疗介导的免疫耐受不同的放疗总剂量及分割模式所产生的免疫效应不同，如何使放疗联合免疫治疗的抗肿瘤效应最大化是值得探索的方向。常规分割放疗是临床放射治疗最普遍的一种治疗形式，与大剂量分割放疗相比，常规分割放疗在促进抗肿瘤免疫应答中主要影响肿瘤血管形成和免疫细胞的浸润［28］，而大剂量分割放疗主要诱导肿瘤微环境变化和产生Ⅰ型干扰素触发固有免疫和适应性免疫应答［29］。多项临床前研究提示大剂量分割放疗联合免疫检查点阻断剂可以增强抗肿瘤免疫效应［19，26］，而对低剂量常规分割放疗的研究较少，近来有学者发现联用PD-L1阻断剂可克服常规分割放疗介导的免疫耐受，这种现象是由于常规分割放疗导致肿瘤细胞表面PD-L1上调，与T细胞表面的PD-1结合后传递负性调控信号，进而导致T细胞耗竭。当放疗与PDL1阻断药物联合应用时，可有效阻断PD-1/PD-L1信号通路，从而增强细胞毒性T细胞对肿瘤细胞的杀伤［4］。另有研究又对这一实验现象作了补充，认为常规分割放疗联合PD-1阻断剂所产生的抗肿瘤免疫反应能够有效控制照射区和非照射区肿瘤的生长，并且这种免疫应答主要依赖原位和外周浸润的多克隆T细胞群［30］。

3 放疗联合免疫检查点阻断治疗的研究进展

放疗与免疫检查点阻断剂相互协同，不仅能够提高放疗的局部疗效，还能有效激活机体抗肿瘤免疫反应，两者联合应用有望成为肿瘤治疗领域一项极具潜力的新策略，但这一治疗模式目前还面临着具体方案尚未明确以及毒性反应叠加等难题。近年来，随着研究的不断深入，对这一联合治疗模式的不断改良与优化，使其突破了原先单一化的治疗模式及技术，能够进一步提高抗肿瘤疗效。

3.1 放疗联合双重免疫检查点阻断剂治疗最新研究表明恶性黑色素瘤患者行放疗联合双重免疫检查点阻断剂较放疗联合CTLA-4阻断剂有更好的疗效［22］。在放疗联合Ipilimumab的Ⅰ期临床试验显示：仅18%的转移性黑色素瘤患者疗效评估部分缓解，这种治疗敏感性低下的现象可能与二联治疗易在患者中引起治疗抗性有关——肿瘤细胞表面PDL1上调进而导致T细胞耗竭。随后研究者在此基础上添加PD-L1阻断剂以逆转T细胞耗竭，研究发现不同肿瘤模型的联合治疗组小鼠较单独治疗组存活明显延长，治疗有效率增加到80%。因此，三联疗法在多种肿瘤类型治疗疗效中的优越性提示每种治疗方式的非冗余机制——放疗可增加肿瘤内T细胞受体（T cell receptor，TCR）库的多样性及其在外周寡克隆扩增频率；阻断CTLA-4主要抑制Tregs，从而增加CD8/Tregs比例。添加PD-L1阻断剂可逆转T细胞耗竭，从而减轻对CD8/Tregs比例的抑制，并进一步促进T细胞寡克隆扩增。

3.2 放疗联合新型免疫检查点阻断剂及共刺激分子治疗放疗联合PD-1/PD-L1/CTLA-4阻断剂在之前的研究中已被证实具有很好的协同抗肿瘤作用，除此以外，其他一些伴随TCR通路激活的免疫抑制分子也被认为是可供干预的新型靶点，包括TIM-3、LAG-3、BTLA、VISTA、B7-H3等。值得一提的是，抗PD-1与抗TIM-3或抗LAG-3抗体的联合应用在临床前研究中取得了协同的抗肿瘤效果，目前也正在积极开展临床试验［31］。Kim等［32］开展了一项立体定向放疗联合抗PD-1抗体、抗TIM-3抗体治疗GL261胶质瘤的动物实验，研究显示联合治疗组较单独放疗组小鼠具有显著的生存获益。除免疫抑制分子型抗体的应用以外，4-1BB、OX40、IDO等T细胞共刺激分子的抗体通过增强抗肿瘤免疫细胞活性，在不同肿瘤的研究中取得了一定临床疗效，将为联合放疗提供新的思路［33-34］。抗OX-40的激动性抗体联合抗CTLA-4治疗可显著提高TRAMP-C1前列腺癌、MCA-205肉瘤荷瘤动物模型的生存率［35］。另一种共刺激分子4-1BB的特异性抗体联合CTLA-4阻断、CD40活化、放射治疗以及肿瘤疫苗时均展现出一定的抗肿瘤活性［36］。相较于免疫抑制分子在正常免疫系统具有促进外周耐受的作用，这一类免疫共刺激分子在活化T细胞的同时并不会引起外周耐受，故使用这种活化型抗体不会引起严重的自身免疫反应，减轻了联合治疗所造成的叠加毒性［37］。

3.3 放疗联合免疫检查点基因敲除的细胞免疫治疗免疫检查点阻断剂会对皮肤、肝、肺以及胃肠道系统造成一定的损伤［38］，而放疗对正常组织器官也有一定程度的损伤，故联合治疗在提高抗肿瘤疗效的同时也会导致毒性反应叠加，因此放疗联合免疫检查点阻断剂的毒副作用是影响其向临床转化的主要限制因素之一。为攻克这一难题，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除表达于T细胞上的负性调节分子来调控其活化功能，从而逆转免疫耐受被认为是极具潜力的发展方向，其可有效替代免疫检查点单抗药物长期的、全身性的应用并实现“精准打击”，从而减轻药物所引起的不良反应［39-40］。通过CRISPR-Cas9基因编辑技术，建立低剂量放疗联合免疫抑制检查点基因敲除的EBV相关胃癌细胞毒性T细胞过继性回输的治疗模式，实验结果发现PD-1敲除的T细胞联合低剂量放疗组和单独放疗等对照组相比，对EBV相关胃癌裸鼠皮下移植瘤有着更强的局控作用，机制上可能与基因敲除后的T细胞活化、杀伤能力增强以及肿瘤放疗增加这一类T细胞趋化浸润至肿瘤组织有关［41-42］。

4 结语与展望

放疗联合免疫检查点阻断剂的治疗模式是今后癌症治疗的发展趋势之一。大量临床前研究已证实联合治疗可以有效激活机体抗肿瘤免疫反应，但相关机制仍需进一步研究；此外，目前的报道多集中于恶性黑色素瘤、乳腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌、前列腺癌，未来相关研究需要在不同肿瘤中寻找最优的联合治疗策略，包括放疗部位的选择、放疗的分割模式与总剂量、联合治疗的时间窗、有效的生物反应标志物判断预测疗效等。此外，各类免疫检查点阻断剂联合放疗向临床转化的关键在于筛选合适的目标人群和评估联合治疗的安全性。PD-L1表达率、微卫星不稳定状态和肿瘤突变负荷是否可以作为免疫检查点阻断剂的生物标志有待进一步临床验证；而针对免疫相关性不良反应的管理也需进一步优化，除了免疫调节药物的减量或停用、合理应用糖皮质激素及免疫抑制剂以外，序贯应用肿瘤治疗性疫苗或过继性细胞回输治疗、添加免疫共刺激分子激动剂来减少免疫检查点阻断型抗体的持续应用也不失为一种新型治疗策略。总体而言，放疗与免疫检查点阻断治疗的联合应用在肿瘤综合治疗中具有广阔的前景，并且这一联合治疗模式经不断改良与优化后，有望在未来肿瘤治疗中发挥重要作用。