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(1.黑龙江大学农业微生物技术教育部工程研究中心,黑龙江哈尔滨 150500; 2.黑龙江大学生命科学学院,黑龙江省普通院校微生物重点实验室,黑龙江哈尔滨 150080; 3.西藏农牧学院食品科学学院,西藏林芝 860000)

凝集素是一类能够凝集血红细胞且具有糖特异性的蛋白质或糖蛋白[1]。凝集素最早是从蓖麻种子中发现的,后来又从动物体内中发现,在自然界中种类繁多、分布广泛,微生物、动物、植物中均含有凝集素。凝集素参与生物的各种过程,包括细胞识别、细胞增殖、细胞迁移、细胞粘附于细胞外基质等。凝集素按照其来源可分为植物凝集素、动物凝集素和微生物凝集素。

前期学者对植物中的凝集素研究较为深入,大多是关于豆科植物种子的报道。现在越来越多的凝集素是从海洋生物中分离出来,现已知有300多种凝集素是从海洋生物中提取出来[2]。对这些海洋生物凝集素的研究都集中在具有生物医学应用的抗菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂、抗肿瘤剂、抗伤害感受剂和抗炎剂等方面。随着大型真菌培养技术的发展,目前,已经从300多种大型真菌中分离提取出凝集素,并对其进行了初步研究[3]。研究表明凝集素具有抗肿瘤[4]、免疫调节[5]、抗病毒[6]等生物活性。在免疫调节过程中,凝集素可以发挥重要的作用。凝集素被定性为免疫调节剂,可诱导某些细胞因子和反应物的产生,对肿瘤或微生物的感染具有有效免疫应答的作用[7]。大多数凝集素可以通过Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)激活巨噬细胞,刺激T细胞、B细胞增殖,诱导细胞因子的分泌,发挥免疫调节作用。TLRs是非特异性免疫中的较为重要蛋白质分子,也是联系特异性免疫和非特异性免疫的桥梁。TLRs在巨噬细胞识别细胞外信号中起到重要的作用。TLRs不仅可以参与非特异性免疫调节,还能诱导细胞因子表达,激活细胞信号通路。本文就TLRs的特征和凝集素对免疫调节作用的现状进行概述。

1 凝集素分离纯化及生物活性概述

1.1 凝集素分离纯化

研究表明,不同来源凝集素的分离纯化方法存在很大的相似性。主要是通过PBS浸提、硫酸铵沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析,如草菇凝集素[8]、黄牛肝菌凝集素[9]、双孢蘑菇凝集素[10]、白芸豆凝集素[11]、菜豆凝集素[12]等;也可以通过PBS浸提、硫酸铵沉淀、离子交换层析分离纯化,如苦荞凝集素[13]、大蒜凝集素[14]等;也有少数是通过PBS浸提、亲和层析直接分离纯化,如贻贝凝集素[15]等。在利用亲和层析纯化时,需要获悉与待分离凝集素特应性结合的物质,配制相应亲和层析胶。在提取未知凝集素时很难确认这种凝集素相应的配体,因此用亲和层析纯化存在一定的困难,这也是很少用这种方法的原因。

凝集素分离纯化后需要分析鉴定它的性质,用SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)和Native-PAGE(非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测凝集素的纯度和分子质量[16];用Edman法检测凝集素的N末端序列[17]。通过检测分子质量、亚基数量、等电点、N末端序列等判断凝集素的种类及结构特点,也可以通过傅里叶变换红外光谱、X射线衍射等方式检测凝集素的高级结构[18]。结构决定功能,凝集素的结构与功能之间存在紧密的联系。凝集素特殊的结构对于识别靶细胞表面的受体有着重要的意义。大多数凝集素表面具有特异性糖结合位点,这种特性是由凝集素特定的蛋白质结构决定[19]。凝集素可以凝集细胞表面的糖类物质,或者与周围环境中的糖类物质结合形成糖蛋白,因此凝集素主要是以蛋白质或多糖复合物的形式存在,其多种生物活性可能与这种特性有关[1]。

1.2 凝集素生物活性

凝集素具有多种生物活性。在抗肿瘤方面,猴头菇凝集素[20]可以抑制人乳腺癌MCF-7和人肝癌HepG2细胞的增殖;巴西毛果种子凝集素[21]可以抑制肺癌A549、人卵巢癌A2780、乳腺癌MCF-7的增值;巴西利马豆凝集素[22]可以抑制鼠黑素瘤细胞的增值。在免疫调节方面,KML是一种从Korean mistletoe中分离到的一种凝集素,它可以调节巨噬细胞介导免疫反应,促进多种细胞因子(IL-3、TNF-α)的表达和ROS的产生,可以增强巨噬细胞的吞噬作用[23];用洋葱凝集素ACA处理RAW264.7细胞及大鼠腹腔巨噬细胞24 h,NO、IL-12和TNF-α的表达量明显增加[24]。在抗菌方面,树舌凝集素可以抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌的生长[25];黑芸豆凝集素在20 μg/mL时,可以抑制黑曲霉、香蕉尖孢镰刀菌、锥栗炭疽病病菌、莲细极链格孢菌、瓜果腐霉病菌、葡萄灰霉菌[26];桑叶凝集素可以抑制绿色木霉菌、苹果落叶病菌、西瓜枯萎病菌、烟草黑胫菌等病菌[27]。在抗病毒方面,杨树菇凝集素可以有效抑制烟草花叶病毒(TMV)[28]。绣球藤凝集素可以抑制牛痘病毒和水泡口炎病毒[29]。

2 TLRs信号通路概述

Toll样受体首次发现于果蝇,因与果蝇蛋白Toll具有较高的同源性,故称为Toll样受体[30],之后在哺乳动物体内也发现了Toll样受体的存在。TLRs是最早发现的天然免疫模式识别受体(PRRs),可以识别外源的病原菌相关分子模式(PAMPs)、内源的损害相关分子模式(DAMPs)和异源物先关分子模式(XAMPs)[31]。TLRs是一类Ⅰ型跨膜蛋白质,由三部分组成,包括亮氨酸重复序列、跨膜结构域和TIR结构域。TLRs与配体识别的关键部位是由19～25个亮氨酸重复序列组成的,活化TLRs的结构是TIR结构域[32]。TLRs主要在免疫细胞中表达,如巨噬细胞、树突细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞等[33]。TLRs与相关接头蛋白结合后,可以激活下游信号通路,诱导吞噬细胞、淋巴细胞等释放炎症介质,杀死外来的病原体[34]。TLRs是非特异性免疫识别的关键受体,在由炎症反应、肿瘤等引起的免疫性疾病调节中起到重要的作用。食用菌凝集素免疫调节主要是通过刺激TLRs信号通路完成的。

2.1 TLRs家族成员的介绍

TLRs家族包含13个成员。在TLR家族这个大家庭中,根据它们在细胞中的定位和各自的PAMP(病原体相关分子模式)配体可以分成两个亚组。TLR11与TLR5具有同源性,位于细胞表面;TLR13位于细胞囊泡中[35-36]。TLR10与TLR1相似,具有与TLR2形成二聚体的接口和脂肽结合的通道[37]。TLR1、2和6识别脂肽和糖脂,TLR7、8和9识别核酸如ssRNA和未甲基化的CpG DNA,TLR3区分与病毒感染相关的dsRNA、TLR4识别纤维蛋白、脂多糖(LPS)和热休克蛋白,TLR5鉴定细菌鞭毛蛋白,TLRs 11和12识别肌动蛋白结合蛋白[38]。其中TLR4是发现的第一个人类细胞表面的TLRs受体蛋白,也是最复杂的,几乎分布于所有细胞中[39]。

2.2 TLRs介导的细胞信号通路

图1 TLRs信号通路活化机制Fig.1 Mechanism of TLRs signaling pathway activation注:P13K:磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase);Akt:丝/苏氨酸蛋白激酶B(serine/threonine kinase B);TAK-1:转化生长因子激活激酶(TGF-β-activated kinase-1);MAPK:丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase);IκB:抑制剂-κB(inhibitor-κB);IKK:IκB激酶(IκB kinase);JNK:c-Jun N末端激酶(c-Jun N-terminal kinase);p38:p38蛋白(p38 protein);NF-κB:核转录因子-κB(nuclear factor kappa B);AP-1:激活蛋白-1(activating protein-1);IRF-3:干扰素调节因子-3(interferon regulatory factor-3)。

TLRs信号通路如图1[40]所示,TLRs在细胞内信号传导中起着重要的作用。凝集素与细胞表面的TLRs受体结合,激活TLRs,启动下游信号,激活细胞内MAPK信号通路和NF-κB信号通路,调节肿瘤坏死因子、白细胞介素、干扰素等细胞因子的产生[41]。TLR受体与凝集素结合并激活TLR,激活后的TLR可以与MyD88结合,也可以与TRIF结合。

当TLR与MyD88结合后,可以启动MyD88依赖途径。MyD88募集IRAK家族成员并激活IRAK4、IRAK1、IRAK2和IRAKM[34]。IRAK4最初被激活,并且在MyD88下游的NF-κB和MAPK的激活中具有重要作用[42]。IRAK活化导致与TRAF6的相互作用,TRAF6是一种E3连接酶,其催化与靶蛋白上的K63(Lys63)连接的多聚泛蛋白的合成,包括TRAF6本身和IRAK1,以及二聚体E2遍在蛋白缀合酶Ubc13和Uev1A[43]。然后,K63连接的多聚泛蛋白链与TAB-2的新的锌指型泛素结合结构域和激酶TAK-1复合物的调节组分TAB-3结合,以激活TAK-1[44]。TAK-1通过诱导MAPK激酶的磷酸化,同时激活ERK、p38和JNK,然后MAPK激酶激活各种转录因子(包括AP-1),并影响翻译[45]。同时,K63连接的多聚泛蛋白链还可以与NEMO的泛素结合结构域结合,NEMO是NF-κB活化所需的IKK复合物的必需调节组分[46]。因此,K63多聚泛蛋白链可能是负责募集TAK-1以与IKK形成复合物,从而允许TAK-1通过其与IKK复合物的紧密接近来磷酸化IKKβ,其通过磷酸化和随后的IκB蛋白降解导致NF-κB活化[47]。

当TLR与TRIF结合后,可以启动TRIF依赖途径。TRIF与P13K结合,诱导NF-κB的活化;TRIF与TRAF6结合,诱导IRF-3的活化,引起ITF-β的表达[48]。TRIF依赖途径的下游有TRAF3和TRAF6两个肿瘤坏死因子相关受体因子。研究结果表明,在缺少TRAF3时Ⅰ型干扰素产生量减少;缺少TRAF-6时Ⅰ型干扰素产生量没有减少,这说明,TRAF-3在TRIF依赖途径发挥重要的作用[49]。TRIF依赖途径主可以调节干扰素相关蛋白的表达、诱导树突细胞成熟和诱导ITF-β的表达等。

3 凝集素通过TLRs信号通路的免疫调节作用

3.1 微生物凝集素

大型真菌凝集素可以通过TLRs信号通路刺激免疫细胞的增殖提高巨噬细胞的吞噬作用以及增强细胞因子和炎性因子的分泌,并且TLRs在肿瘤免疫监视中也可能发挥作用[33]。大多数大型真菌凝集素是通过TLRs信号通路调节免疫系统的。如姬松茸刺激T细胞上的树突状细胞,作用CLRs凝集素受体指导T细胞实现内吞过程,分泌TNF-α,完成免疫调节作用[50]。灵芝凝集素在体外可以激活小鼠脾细胞,在体内具有免疫调节作用,能促进人外周血淋巴细胞有丝分裂[28]。表1列举了几种食用真菌凝集素通过TLRs信号通路的免疫调节作用[51]。

表1 几种大型真菌凝集素诱导产生的细胞因子Table 1 Some large fungus lectins that induce cytokines production

表2 几种植物凝集素诱导产生的细胞因子Table 2 Several plant lectins that induce cytokines production

3.2 植物凝集素

植物凝集素的免疫调节活性是它们与聚糖的相互作用,激活免疫细胞表面的受体有关,其相互作用可能触发TLRs信号通路,产生某些细胞因子,相关细胞因子见表2[52]。因此,具有免疫调节作用的凝集素存在潜在的药用价值。树菠萝凝集素与TLR2的糖基结合诱导IL-12的表达[53]。苦荞麦凝集素可以刺激树突细胞的成熟,调节机体免疫[54]。洋葱凝集素可以刺激巨噬细胞RAW264.7,通过MAPK和NF-κB信号通路刺激促炎性因子TNF-α、IL-12和IFN-γ的表达[20]。扁豆凝集素与甘露糖/半乳糖特异结合能够诱导鼠淋巴细胞产生IL-2。

3.3 动物凝集素

随着对动物凝集素的深入研究,发现动物凝集素也可以通过TLRs信号通路进行免疫调节作用。贻贝凝集素与N-乙酰半乳糖胺/半乳糖特异性结合后分别处理鼠巨噬细胞RAW264.7、鼠骨髓巨噬细胞、人巨噬细胞THP-1,通过活性氧ROS、丝裂原活化的蛋白激酶、蛋白激酶C-α/δ和NF-κB等途径使得NO、TNF-α、IL-6的释放量均明显增加[55]。蛇毒C型凝集素通过MAPK和NF-κB信号通路激活巨噬细胞,调节机体免疫[56]。家蛹凝集素可以通过TLR4/NF-κB信号通路,使iNOS表达和NO合成与释放[57]。

4 展望

凝集素在自然界分布广泛,且具有多种生物活性。存在于免疫细胞表面的凝集素和聚糖物质之间的相互作用可能引发分化免疫调节作用,包括细胞增殖和激活以及细胞因子产生的刺激[58-59]。先天免疫系统是保护人体免受微生物、过敏原和癌症侵害的核心。TLR家族及其下游细胞内信号分子在先天免疫中起着重要作用,这些信号通路的激活导致各种抗炎和促炎症分子的表达,这些分子调节代谢和体内平衡[60]。通过TLRs可调控炎性反应,为以后疾病的预防和治疗提供新的治疗策略[61]。凝集素通过TLRs信号通路,可以诱导白细胞介素、干扰素等细胞因子的产生,还可以刺激巨噬细胞、树突细胞等免疫细胞的增殖与分化。大型真菌凝集素能刺激淋巴细胞转化为淋巴母细胞,可以通过检测淋巴母细胞的转化情况,反应细胞免疫水平,监视免疫调节情况。

利用凝集素的免疫调节作用预防治疗疾病将成为凝集素的最重要的研究方向。凝集素的快速发展也为开发保健性食品或药物提供了重要的依据。虽然凝集素对的免疫调节已经研究了很多,但是由于凝集素的种类众多,所以对于每种凝集素具体的调节作用还需具体研究,不能以偏概全。