毕云枫,陶伟明,王溪竹,李彤昕,闫 璐,孙 航,郑明珠,刘景圣

(吉林农业大学食品科学与工程学院,吉林长春 130118)

阿尔茨海默症(Alzheimer’s Disease,AD)又称老年痴呆,属于退行性疾病的一种,此病以认知功能障碍和记忆力减退为主要特征,是目前死亡率最高的四大疾病之一,预计到2050年,全世界85人中将有1人患有此病[1-3]。阿尔茨海默症早期阶段的表现为轻度认知障碍(mild cognitive impairment,MCI)[4-5],该病起病隐匿,病程较长[6],且MCI转为AD的危险性比正常人群高10倍,若能尽早发现并干预,可以减轻患者症状,延缓病情发展[7]。认知功能下降主要与胆碱能神经传递完整性降低有关。由于东莨菪碱诱导的遗忘症是由胆碱能信号传导阻滞引起的,因此它被用于模拟AD相关的认知缺陷[8-9]。乙酰胆碱(Acetylcholine,Ach)是一种神经递质,属于中枢胆碱能系统,在记忆调节中起着重要作用[10]。东莨菪碱是毒蕈碱拮抗剂,诱导中枢胆碱能阻滞,并可在记忆维持中产生可逆损伤可用于AD建模[11]。

人参指五加科植物人参的干燥根和根茎,在世界范围内用于预防各种疾病,包括抗疲劳、抗压力、免疫调节、抗癌症等[12-13]。商崇智等[14]发现Rg2能改善东莨菪碱诱导的AD小鼠的记忆;Gong等[15]研究人参皂苷Rg2能显著改善血管性痴呆大鼠的学习记忆障碍;张敏等[16]报道了人参皂苷Rg2可以减轻大鼠海马神经元的损伤,从而提高学习记忆能力。人参皂苷Re、Rg1、Rg2是主要的三醇组天然皂苷,但是随着人参皂苷生物降解技术的发展,人参皂苷Re、Rg1、Rg2均可被降解为人参皂苷Rh1[17-18]。人参皂苷Rh1在C-6键上比Rg2少一个鼠李糖糖苷键,其结构如图1所示[19]。已有研究证实,人参皂苷Rh1具有抗癌、抗肿瘤、治疗皮肤疾病、提高免疫力等功效[20-23]。Wang等[24]发现Rh1对行为测试和电生理学研究中的记忆障碍和海马兴奋性均有改善作用,但国内外对人参皂苷Rh1改善认知障碍的研究尚少。

图1 人参皂苷Rh1结构图Fig.1 Structure diagram of ginsenoside Rh1

因此,本文向雄性昆明小鼠腹腔注射东莨菪碱建立AD模型,以石杉碱甲作为阳性对照组,研究人参皂苷Rh1对模型小鼠轻度认知障碍的改善作用,为其开发成为延缓AD药物作参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

昆明小鼠 40只,雄性,6周龄,22～30 g,合格证编号:SCXK(吉2017-0005),长春市生物制品研究所有限责任公司;人参皂苷Rh1(纯度>98%) 北京英纳泽信化工技术研究所;氢溴酸东莨菪碱 山西玉宁生物公司;石杉碱甲 批号H10960133,上海复旦复华药业有限公司;乙酰胆碱测定试剂盒 南京建成生物工程研究所。

ZH-800S跳台仪 淮北正华生物仪器设备有限公司;BA-200小鼠避暗仪 成都泰盟科技有限公司;WMT-100S Morris水迷宫视频跟踪系统 成都泰盟软件有限公司;SynergyTM2多功能酶标仪 美国Biotek公司;Neofuge 23R台式高速冷冻离心机 上海力申科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 将小鼠放在室温(22±1) ℃,湿度50%±5%环境下,12 h光暗周期(08:00 am～08:00 pm)适应5 d。小鼠被随机分成6组(n=30),每组6只。空白组:灌胃10 mL/kg等剂量生理盐水;阴性对照组:灌胃10 mL/kg等剂量生理盐水;阳性对照组:灌胃66.7 μg/kg的石杉碱甲;人参皂苷Rh1低剂量组:灌胃5 mg/kg;人参皂苷 Rh1中剂量组:灌胃10 mg/kg;人参皂苷Rh1高剂量组:灌胃15 mg/kg。每天灌胃相应药物共4周。除空白组外,其他实验组每天(07:00 am～08:00 am)腹腔注射1 mg/kg的东莨菪碱,建立认知障碍模型。4周之后进行行为学试验,试验前1 h给予相应药物,30 min之后腹腔注射1 mg/kg东莨菪碱[25]。

1.2.2 避暗试验 潜伏期为每只小鼠从放入明室开始到第一次进入暗室后所遭电击的时间。由于小鼠是夜间行进动物,本能会逃向暗处,在暗室以电击刺激来训练小鼠的空间学习记忆。训练阶段:将每只小鼠放入明室,5 s后将门升起,一旦动物完全进入暗室(所有爪子),立即关闭门,并且将32 V不可避免的电击传递给小鼠的脚2 s。然后将小鼠移至明室,5 min后重复该过程。当小鼠连续5 min停留在光照室时,训练结束。24 h后进行测验,记录每只小鼠进入暗室的潜伏期和5 min内进入暗室的错误次数。停止训练5 d后进行消退试验[26]。

1.2.3 跳台试验 跳台试验是一种普遍的对小鼠在药物和其他干预措施之后进行神经行为学评估的方法。试验时,小鼠放在箱内的绝缘平台上到第一次跳下平台的时间被称为潜伏期。训练阶段:将小鼠预先放入暗箱中适应3 min后,立即用32 V交流电刺激,然后将小鼠放在平台上适应一段时间。测验阶段:24 h后进行测验,将小鼠放置在平台上后开始计时,记录潜伏期和5 min内的跳下平台的错误次数。停止训练5 d后进行消退试验[27]。

1.2.4 Morris水迷宫试验 此实验是根据小鼠在水中有逃避水源的本能,并且会以最快的途径逃出水源,学会逃避水源的过程体现小鼠的记忆力能力。此次试验训练阶段为其5 d。将游泳池分为4个象限,将一个白色的逃生平台放在水面以下0.5 cm并位于第2象限处,平台的位置在实验期间是固定的[28]。整个试验期间水温保持在(30±1) ℃,并在30 cm深的水里加入500 mL牛奶。训练阶段:第1 d,将小鼠放在平台附近,允许其自行爬上3次,停留30 s后在下一象限继续训练。如果小鼠在90 s内没有找到平台,则将其引至平台并在平台上停留30 s,然后在下一象限进行训练。之后的4 d训练,每次都先将小鼠放在平台附近,使其自行爬上1次,以进一步确定训练结果。

表1 人参皂苷对小鼠避暗试验的影响Table 1 Effects of ginsenosides on passive avoidance test in

注:阴性组与空白组比较,#P<0.05,##P<0.01;与阴性组比较,*P<0.05,**P<0.01;表2,图2～图3、图5同。

表2 人参皂苷对小鼠跳台试验的影响Table 2 Effects of ginsenosides on step-down avoidance test in

24 h后进行最后测验。记录60 s内每只小鼠爬上平台所花费的时间以及小鼠的游泳路径。动物行为由摄像机记录并通过特定软件分析[29]。

1.2.5 脑海马体中乙酰胆碱含量测定 Morris水迷宫试验完成后,按照Sultan[30]的方法立即将小鼠脱颈椎处死,然后在冰上解剖小鼠脑海马体,存放于100%甲醇中匀浆脱蛋白。将匀浆离心(15000×g,4 ℃)10 min,并保存上清液[31],使用试剂盒测定Ach水平。

1.3 数据处理

数值表示为平均值±标准差。数据分析使用Microsoft Excel 2010和SPSS 23.0软件,统计学显著性设定P<0.05或P<0.01。

2 结果与分析

2.1 人参皂苷Rh1对小鼠避暗试验的影响

如表1所示,与空白组相比,阴性对照组测验潜伏期与测验错误次数都极显著高于空白组(P<0.01),说明造模有效。药物治疗后,Rh1低、中剂量组消退试验潜伏期接近空白组;与阴性对照组相比,阳性对照组、Rh1低剂量组消退试验潜伏期显著增加(P<0.05),Rh1中剂量组极显著提高(P<0.01)。与阴性对照组相比,阳性对照组和Rh1中剂量组的消退试验错误次数显著减少(P<0.05),且Rh1中剂量组略优于阳性对照组。在避暗试验中,Rh1高剂量组对小鼠认知障碍的改善效果并不明显。

2.2 人参皂苷Rh1对小鼠跳台试验的影响

如表2所示,与空白组比较,阴性对照组跳台测验潜伏期极显著(P<0.01)缩短,测验错误次数极显著(P<0.01)增加,说明造模是有效的。阳性对照组和Rh1低、中剂量组与阴性对照组相比,消退试验潜伏期明显延长(P<0.05或P<0.01);Rh1三个剂量组的消退试验错误次数也明显减少(低、高剂量组P<0.05,中剂量组P<0.01)。Rh1中剂量组的疗效与阳性对照组相近。

2.3 人参皂苷Rh1对小鼠Morris水迷宫试验的影响

从图2可知,阴性对照组与空白组相比,找到平台的时间极显著增加(P<0.01),说明其学习记忆能力明显衰退。与阴性对照组进行比较,Rh1低、高剂量组找到平台的时间显著缩短(P<0.05);阳性对照组和Rh1中剂量组极显著降低(P<0.01),且这两组小鼠的游泳速度明显快于阴性对照组(P<0.05，图3)。图4为部分小鼠的游泳路径,空白组的小鼠可以快速且直接的找到平台;阴性对照组的小鼠直到60 s结束仍未找到平台;阳性对照组的小鼠最初游到泳池的第4象限,但很快找到位于第2象限的平台;Rh1中剂量组的小鼠游泳路径与阳性对照组相似,但在第4象限停留时间稍长;Rh1低、高剂量组的小鼠也可在60 s之内找到平台,但比中剂量组的游泳路线更复杂。Rh1中剂量组游泳速度以及找到平台的时间几乎接近阳性对照组,意味着Rh1中剂量组最接近石杉碱甲的药效。

图2 人参皂苷对小鼠水迷宫试验的影响Fig.2 Effects of ginsenosides on Morris water maze test in

图3 人参皂苷对小鼠游泳速度的影响Fig.3 Effects of ginsenosides on

图4 水迷宫试验中各组小鼠的游泳路径Fig.4 Representation of swimming paths during the Morris water maze test of mice注:a：空白组;b：阴性对照组;c：阳性对照组; d：Rh1-低;e：Rh1-中;f：Rh1-高。

图5 人参皂苷对小鼠脑海马体中 Ach含量的影响Fig.5 Effect of ginsenosides on Ach

2.4 人参皂苷Rh1对小鼠脑海马体中Ach含量的影响

从图5可以看出,东莨菪碱的干预降低了小鼠脑海马体中Ach含量,而经过药物治疗之后,又可以显著提高其含量(P<0.05)。其中,阳性对照组、Rh1低、中剂量组与阴性对照组相比差异显著(P<0.05)。

3 讨论与结论

随着老龄化社会的到来,AD也逐渐成为了越来越严重的社会问题[32]。目前仍未发现有效的治疗途径能从根本上防治AD。人参皂苷作为人参的有效活性成分之一,具有对神经系统的保护作用,能够有效防治AD[33]。崔婧[33]研究表明,人参皂苷Rg2可以抑制Aβ25-35导致的凋亡相关蛋白表达变化,从而达到抗阿尔茨海默病的作用。而Rh1作为Rg2的主要代谢产物,是否具有调节凋亡蛋白表达能力的药理活性,其作用机制与Rg2是否相同,成为本研究关注的焦点。

本研究结果提示,Morris水迷宫实验、跳台试验、避暗试验中模型组小鼠潜伏期极显著(P<0.01)延长、测验错误次数多、有效区域游泳时间和路程长,说明模型组小鼠存在严重的认知障碍。给予人参皂苷Rh1后,小鼠逃避潜伏期显著(P<0.05)缩短、消退试验错误次数明显减少、有效区域滞留时间和路程缩短、其空间辨别行为障碍显著(P<0.05)改善,说明人参皂苷Rh1可对小鼠的认知能力有显著(P<0.05)改善,对脑海马体中Ach含量具有一定提高作用。从试验结果可以看出,即使Rh1低剂量组,改善记忆的作用仍然明显。在高剂量组,可能由于浓度过高(15 mg/kg),故其改善小鼠学习和记忆的作用没有中剂量组明显,原因有待进一步深入研究。Rh1中剂量的药效更有助于小鼠改善记忆,由此确定Rh1中剂量(10 mg/kg)改善小鼠认知障碍的效果最好,且效果与石杉碱甲相当。

综上所述,人参皂苷Rh1可以明显提高AD模型小鼠海马体中乙酰胆碱含量,为人参皂苷Rh1应用于AD的临床治疗提供了重要依据。