,3,*

(1.山东省农业科学院农产品研究所,山东省农产品精深加工技术重点实验室, 农业农村部新食品资源加工重点实验室,山东济南 250100; 2.奥本大学生物系统工程学院,美国阿拉巴马州 36849; 3.北京工商大学,北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,北京 100048)

牡蛎含有丰富的营养物质,有“海洋牛奶”之称,是一种药食同源的海洋生物,具有较高的营养价值和一定的药理作用[1]。开壳牡蛎因缺少保护组织而容易遭受微生物的侵染,直接影响新鲜牡蛎的销售,还会对鲜牡蛎的食用安全造成隐患。同时,随着人们对食品安全的重视,天然、绿色的生物防腐剂受到越来越多的青睐。茶多酚、山梨酸钾、普鲁兰多糖以及乳酸球菌复合型天然防腐保鲜剂在牡蛎的冷储保藏研究中均表现出较好效果,可显著延长货架期,表明生物防腐保鲜剂用于牡蛎保鲜是切实有效的[2-3],这对于延长去壳牡蛎保鲜期,促进养殖牡蛎的发展有一定作用。

ε-聚赖氨酸水溶性好,具有较高的安全性,能够在人体内分解为赖氨酸,其抑菌范围广,能够抑制革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母菌、丝状真菌及病毒等多种微生物[4-5],用于米饭、软饮料、沙拉、奶酪、鱼[6-7]和即食烤牛肉[8]等的防腐保鲜,效果显著。因此,本研究以ε-聚赖氨酸为研究对象,以开壳牡蛎的各项参数为评价指标,考查其对牡蛎贮藏过程中的防腐抗菌效果。有研究使用0.1%、1%和2%浓度的ε-聚赖氨酸作用于即食烤牛肉,结果显示其能有效控制7 d内牛肉中病原菌的数量[8],为探究ε-聚赖氨酸抗牡蛎微生物增殖的有效浓度范围,参考上述实验结果,并考虑病原菌和研究对象的差异性,本实验初步确定较为宽泛的ε-聚赖氨酸试验浓度为0.2%、2%,以期为后续深入研究提供有效数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牡蛎(Crassostreavirginica) Bon Secour Fisheries公司提供,采集于阿拉巴马州墨西哥湾,去壳后加冰运送,次日抵达实验室,直接送入4 ℃冷藏库;ε-聚赖氨酸(3500～4500 Da) Carbosynth公司,用无菌水配制成0.2%和2%的质量浓度,用于保鲜实验;邻苯二甲醛溶液(o-phthalaldehyde,OPA)、9-芴甲基氯甲酸酯溶液(9-fluorenylmethyl chloroformate,FMOC)、硼酸盐缓冲溶液 Agilent试剂公司;氨基酸标准溶液 Sigma试剂公司;其他化学试剂 均为分析纯。

Whirl-PakTM过滤袋(254×300 mm) NascoTM公司;BagMixer 400W拍打式均质器 Interscience公司;BUCHI Mixer B-400均质仪 BUCHI公司;TA-XT2i质构仪 Stable Microsystems公司;Vibra cellTM裂解仪 Sonics公司;Agilent 1260高效液相色谱仪 Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 牡蛎保鲜预处理 开壳牡蛎用超纯水冲洗除去表面黏液和附着物,沥干水分后,选取大小均一的个体随机分组,单个牡蛎重量为13～15 g,使用浓度为0.2%和2%的无菌ε-聚赖氨酸溶液浸润处理(每10颗牡蛎浸于200 mL溶液),以无菌水处理过的牡蛎为空白组,沥干后置于自封袋中,每组8个牡蛎,在(4±1) ℃条件下进行试验,在0、5、10、13、16 和19 d取样检测。

1.2.2 细菌总数测定 取一整颗牡蛎置于无菌过滤袋中,加入90 mL无菌水,用拍打式均质器均质10 min,从无菌袋另一侧取滤液作为供试样品,参照国家标准GB 4789.2-2016《食品微生物学检验菌落总数测定》进行牡蛎中菌落总数的测定。

1.2.3 pH测定 称取5 g匀浆的牡蛎肉糜,加入50 mL的去离子水,裂解仪超声震荡30 s,离心后使用pH计测定上清液pH。

1.2.4 挥发性盐基氮(Total volatile basic nitrogen,TVB-N)测定 称取10 g匀浆的牡蛎肉糜,加入4%的三氯乙酸溶液(Trichloroacetic acid,TCA)40 mL,裂解仪超声震荡30 s,室温27 ℃静置30 min,4500 r/min、25 ℃离心15 min,取上清液作为供试样品[9],参照国家标准GB 5009.228-2016《食品中挥发性盐基氮的测定》进行TVB-N的测定,以4%的TCA作为对照,实验结果取3次测量的平均值。

1.2.5 质构TPA的测定 采用TA-XT2i质构仪TA30探头,使用5 kg的力量感应元校准,取一整颗牡蛎置于探头正下方,参考文献[9]所述设置操作参数。基本参数如下:测试加速度为 2 mm/s,压缩形变量设为50%,完成两个按压动作,两次按压时间间隔为5 s。试验数据由计算机自动读取,每组设置6个平行。

1.2.6 游离氨基酸(Free amino acids,FAA)的测定 称取0.2 g匀浆的牡蛎肉糜,加入1 mL的10% TCA,超声震荡30 s后,室温27 ℃静置15 min,15000 r/min、25 ℃离心15 min,上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤后作为供试样品。样品经程序进样处理(Agilent application note 5990-5599EN),吸取1 μL供试样品、2.5 μL硼酸盐缓冲液、0.5 μL OPA溶液、0.4 μL FMOC溶液、32 μL蒸馏水置于定量环中混合,进样20 μL进行分析。

色谱柱:Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱温:40 ℃;流动相A:10 mmol/L磷酸氢二钠-四硼酸钠(pH8.2);流动相B:乙腈-甲醇-双蒸水(体积比45∶45∶10);梯度洗脱:0～1 min,2% B;1～35 min,2%～57% B;35～55 min,57%～100% B;55～65 min,100% B。流速:1 mL/min;DAD检测波长:338、262 nm(用于蛋白质的检出)。

1.3 数据处理

数据使用Excel 2010软件进行统计分析;方差分析结果均以平均值±标准偏差(Mean±SD)表示;使用SPSS 22.0软件Duncan法进行显著性分析,P<0.01为差异极显著,P<0.05为差异显著,P>0.05为差异不显著;以氨基酸的摩尔浓度(μmol/mL)为横坐标,不同浓度氨基酸峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,根据测定的样品峰面积计算FAA的含量。

2 结果与分析

2.1 ε-聚赖氨酸处理对贮藏牡蛎菌落总数的影响

由图1可以看出,牡蛎贮藏0 d,初始菌落数在4.85lg CFU/g左右,在贮藏5 d时,空白组菌落数已经达到6.14lg CFU/g(增加了1.29lg CFU/g),低浓度处理组(0.2%)为5.03lg CFU/g,而高浓度处理组(2%)仅为4.61lg CFU/g,与空白组相比,试验组菌落数至少低1个数量级,抑制效果显著(P<0.05);2%ε-聚赖氨酸处理组效果较空白组差异极显著(P<0.01);此外,2%ε-聚赖氨酸不仅抑制微生物生长,还有杀菌作用,该组较贮藏0 d菌落数降低了0.24lg CFU/g,减小了4.95%。低浓度ε-聚赖氨酸通过破坏微生物细胞膜导致细胞内代谢失衡来实现抑菌效果;而高浓度的ε-聚赖氨酸导致细胞膜的渗透性明显增加,在细胞膜上形成胶束,磷脂双分子层弯曲并穿孔,最后导致细胞死亡[10-12]。随着贮藏时间的延长,贮藏10 d抑制作用逐渐减弱,与空白组相比,0.2% ε-聚赖氨酸抑菌效果并不显著(P>0.05),菌落数与空白组相近;但2% ε-聚赖氨酸的抑菌效果仍优于另外两组,差异显著(P<0.05)。在第10 d,菌落总数虽然并未达到7lg CFU/g的腐败临界值[13],但空白组牡蛎明显变黏,有异味,已发生轻微腐败,因此将取样间隔调整为3 d。第13 d,高浓度ε-聚赖氨酸处理组菌落数较空白组仍有显著差异(P<0.05),直至第16 d与空白组趋于一致。

图1 牡蛎贮藏过程中菌落总数变化Fig.1 Changes of the total bacterial count of oysters during the storage注:*:P<0.05,相同贮藏时间与空白组差异显著; **:P<0.01,在相同贮藏时间 与空白组差异极显著;图2～图5同。

2.2 ε-聚赖氨酸处理对贮藏牡蛎pH的影响

测得牡蛎初始pH为6.61±0.01,与文献[9]测得值相近。研究表明,牡蛎肉在贮藏过程中,会发生pH先降低后升高的现象[14-15],是由于牡蛎肉中含有较多的糖原,糖原发生分解生成乳酸,以及ATP酶降解释放出无机磷[14],使得牡蛎肉的pH下降,此后牡蛎肉中的蛋白质逐渐分解,产生氨以及胺类等碱性含氮物质,造成pH逐渐升高。图2中,三组牡蛎在贮藏期间pH没有明显上升,贮藏5 d的牡蛎肉的pH没有明显改变(P>0.05),表明此时还未发生糖原的大量分解;但是10 d的pH有不同程度的降低,pH剧烈下降,与两个ε-聚赖氨酸处理组相比,空白组pH降低显著(P<0.05),而高浓度处理组对pH的影响与空白组相比差异极显著(P<0.01),变化趋势与菌落数一致。空白组和低浓度处理组发生pH持续降低,可能是因为微生物降解蛋白质的程度要弱于乳糖的降解速率。高浓度处理组牡蛎在贮藏后期(16～19 d)pH稍有上升,表明该组牡蛎蛋白质分解速度加快,释放碱性含氮物质的量增加。

图2 牡蛎贮藏过程中pH变化Fig.2 Changes of pH of oysters during the storage

2.3 ε-聚赖氨酸处理对牡蛎贮藏期间TVB-N的影响

牡蛎在贮藏过程中由于微生物和酶的作用发生自溶,蛋白质逐渐分解产生胺类等碱性含氮物质,随着牡蛎体内的微生物大量繁殖,生成氨、甲胺和三甲胺等挥发性盐基氮(TVB-N),积累到一定程度时,表明牡蛎进入腐败期,不能食用[14]。图3中贮藏初期0～5 d,空白组和低浓度处理组TVB-N值呈缓慢上升趋势,无显著差异(P>0.05),而高浓度处理组与空白组相比差异极显著(P<0.01);随后在5～10 d,空白组和低浓度处理组的TVB-N值迅速增加,增加了6.79～7.04 mg/100 g,而高浓度处理组仅增加了1.34 mg/100 g,表明高浓度ε-聚赖氨酸能抑制微生物分解蛋白质。推测在贮藏初期,微生物数量少,分解蛋白质的速度慢,随着微生物的大量增殖,降解速率也随之迅速提升。空白组牡蛎在第10 d已经出现轻微腐败现象,而TVB-N值大约在(22.95±0.90) mg/100 g,远低于海产鱼在腐败初期的TVBN值(30 mg/100 g)[16],而本研究实验发现,TVB-N值为20 mg/100 g时,牡蛎已到达腐败初期[2,17],有的研究中TVB-N值仅为10 mg/100 g,牡蛎中菌落数却已经超标,牡蛎也已发生腐败[9,18]。结果表明TVB-N值与牡蛎的腐败程度是相关的,TVB-N值越高,腐败程度越严重;但针对不同品种[18],甚至同一海域的同品种牡蛎[9],不同处理方式,甚至可能源于不同的季节,造成可接受的劣变TVB-N值界限有很大差异,并不能单纯设定一个TVB-N值用于评定牡蛎的新鲜度。

表1 空白组牡蛎质构TPA的变化情况Table 1 Texture profile analysis(TPA)of the control oysters

注:*:P<0.05,相同指标与贮藏0 d牡蛎差异显著;表2同。

图3 牡蛎贮藏过程中TVB-N值变化Fig.3 Changes of total volatile basic nitrogen of the oysters during the storage

2.4 ε-聚赖氨酸处理对贮藏牡蛎TPA质构的影响

通过表1中空白组牡蛎质构结果发现,在贮藏期间,牡蛎即使发生轻微腐败变质,弹性、内聚性和粘附性等参数均没有显著差异(P>0.05),因此,不作为评测牡蛎品质的直接指标。此外,咀嚼性是由硬度、内聚性、弹性共同决定的,有研究发现硬度与咀嚼性呈极显著正相关[19-21],本实验结果也表明,硬度与咀嚼性的变化趋势一致。因此,本研究选择差异性显著的参数(硬度和回复性)作为考察指标,用以评价ε-聚赖氨酸处理对牡蛎贮藏期间质构TPA的影响。

由图4A可知,空白组牡蛎在贮藏初期的0～10 d,硬度快速减小,在10～16 d开始放缓,推测微生物代谢活跃和酶的作用使牡蛎发生自溶,蛋白质逐渐分解导致肉质结构松散,硬度变差[22]。而ε-聚赖氨酸处理过的牡蛎在0～5 d硬度变化趋势与空白组相近,结合高浓度ε-聚赖氨酸组的牡蛎菌落总数、pH和TVB-N值均得到有效控制可知,蛋白质分解程度应优于空白组,但0～5 d各组牡蛎减小趋势一致,表明此时牡蛎硬度的变化与蛋白质的分解无明显相关性,可能是影响牡蛎硬度的其他因素发生变化,如水分、脂肪、盐含量、淀粉含量等[19];贮藏5～10 d，ε-聚赖氨酸处理组的牡蛎硬度减小趋势放缓,优于空白组,但差异并不显著(P>0.05),2%ε-聚赖氨酸处理的牡蛎在10～13 d,硬度增加极显著(P<0.01),表明2%ε-聚赖氨酸对于控制微生物增殖代谢,维持牡蛎硬度有显著效果。

回复性是测量样品从第一次变形中回复的能力[23],牡蛎贮藏过程中回复性变化如图4B所示,空白组牡蛎在0～5 d,回复性迅速下降,此后发生波动下降,可能源于牡蛎自溶致组织软烂,而导致回复性降低;2% ε-聚赖氨酸处理的牡蛎在0～5 d下降趋势减缓,在第10 d差异显著(P<0.05),此后,其回复性变化趋势与空白组一致,差异不显著(P>0.05)。TPA质构结果表明,ε-聚赖氨酸可通过抑制微生物的增殖,延缓牡蛎自溶的程度进而提高牡蛎贮藏品质。

图4 ε-聚赖氨酸处理对牡蛎贮藏期间质构TPA的影响Fig.4 Effects of ε-polylysine treatment on texture profile analysis(TPA)of oysters during the storage注:A:牡蛎贮藏期间硬度的变化; B:牡蛎贮藏期间回复性的变化。

2.5 ε-聚赖氨酸处理对牡蛎贮藏期间FAA的影响

FAA是水产品风味品质和评价鲜度的一个重要指标,在贮藏0 d,对未处理牡蛎中的FAA进行测定,检测出表2中所示的9种游离氨基酸,以丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)的含量最丰富,Ala和Gly为呈甜味氨基酸,Glu为呈鲜味氨基酸[24-26],三者占检出游离氨基酸总量的85.35%。与贮藏0 d相比,Glu含量先升高后降低,差异显著(P<0.05);而Gly含量在5 d显著(P<0.05)降低后,不再升高;Ala则与之相反,在贮藏初期0～16 d,含量无显著变化,反而在16～19 d显著(P<0.05)升高。

表2 未经处理的牡蛎中游离氨基酸的含量Table 2 Free amino acids contents of untreated oysters

注:*:0 d牡蛎中所检测出的游离氨基酸占总游离氨基酸的比例;(+):味道愉悦;(-):味道不佳;-:未有文献报道;ND:未检测出。

图5 ε-聚赖氨酸处理对牡蛎贮藏期间FAA的影响Fig.5 Effects of ε-polylysine treatment on free amino acids of the oysters during the storage注:A:甘氨酸含量变化;B:谷氨酸含量变化;C:丙氨酸含量变化;D:游离氨基酸含量变化。

不同实验组的差异如图5A～图5C所示,在贮藏初期0～5 d,三种主要呈味氨基酸的含量都有不同程度的降低,Gly和Glu下降明显,表明牡蛎的风味品质在变差,而Ala含量在贮藏后期有了大幅提高,变化趋势与陈桂平[27]测定的草鱼冷冻期间氨基酸含量一致。在贮藏的0～10 d,三组牡蛎的三种氨基酸含量没有显著差异(P>0.05),说明ε-聚赖氨酸对牡蛎风味的保持没有作用;而在贮藏后期,在酶和微生物作用下,蛋白质和氨基酸逐渐被分解,使得牡蛎发生腐败变质[28],10 d后的氨基酸变化趋势表明,2%ε-聚赖氨酸处理的牡蛎中,Glu和Gly含量较空白组和低浓度处理组变化平缓,其中,在贮藏16～19 d,Glu含量差异显著(P<0.05),而Ala在16～19 d也表现出了显著差异(P<0.05),表明2% ε-聚赖氨酸能有效控制微生物增殖和代谢活性。FAA总含量的变化趋势更能体现出高浓度ε-聚赖氨酸对微生物代谢活性有抑制作用(图5D),在贮藏后期13 d,随着蛋白质逐渐分解,空白组游离氨基酸含量逐渐升高,高浓度处理组和低浓度处理组游离氨基酸总量要低于空白组,且差异显著(P<0.05);贮藏的第19 d,空白组游离氨基酸总量达到60.52 mg/g,0.2%和2%ε-聚赖氨酸处理组仅为46.17和43.24 mg/g,差异极显著(P<0.01),可见ε-聚赖氨酸能抑制微生物对蛋白质的降解作用,或可间接证明ε-聚赖氨酸通过抑制微生物增殖从而减缓蛋白质的降解过程。

3 结论

两种浓度ε-聚赖氨酸(2%和0.2%)对牡蛎均有防腐效果。未经处理的牡蛎空白组,在贮藏第5 d,菌落数即增加了1.29lg CFU/g,由于牡蛎自溶和蛋白质分解,在贮藏的5～10 d开始,各项参数(pH、TVB-N值、TPA质构、FAA含量)发生明显变化;0.2%ε-聚赖氨酸在保藏初期对牡蛎中微生物增殖有抑制作用,菌落数没有明显增加,在5～10 d效果开始减弱,菌落数迅速增加;2%ε-聚赖氨酸在贮藏初期有杀菌作用,第5 d菌落数甚至减小了4.95%,同时延缓pH和TVB-N的变化程度,在贮藏的10～13 d发生显著(P<0.05)变化。贮藏19 d,高浓度组牡蛎中游离氨基酸增加小于空白组,推测ε-聚赖氨酸可通过缓解牡蛎蛋白质的水解过程,改善牡蛎贮藏时间和产品的品质。结果表明,ε-聚赖氨酸主要通过抑制微生物的生长增殖,并抑制微生物对牡蛎的分解来延长牡蛎的保藏时间。

复合保鲜剂(壳聚糖、茶多酚、溶菌酶)处理牡蛎,能将牡蛎的货架期延长近1倍[2],而徐莉等[3]则采用响应面法对茶多酚、山梨酸、普鲁兰多糖进行复配组合,证实复合保鲜剂的保鲜效果要显著优于单一组分的保鲜剂。本研究证实ε-聚赖氨酸能抑制牡蛎微生物增殖,延缓牡蛎腐败进程,在后续研究中,或可考虑将其与其他保鲜剂复配,制备天然、高效防腐保鲜剂,这对于延长牡蛎保鲜期,应对鲜牡蛎食用安全隐患可提供有效策略。