(石家庄市疾病预防控制中心,河北石家庄 050011)

植物毒素是指某些植物中含有的非营养性天然物质成分,或者是在储存不合理的条件下产生的对人体健康有害的有毒成分,体内超过一定量,则可导致中毒。茄碱常见于土豆中,蓖麻碱常存在于蓖麻油中,秋水仙碱常见于黄花菜中,鱼藤酮存在于豆科鱼藤属植物根中。此外,鱼藤酮作为一种低毒且高效的杀虫剂,常被应用于农作物虫害防治。对于人们经常食用的凉拌菜来说,多由黄花菜、土豆丝和绿色蔬菜等拌制而成,若使用发芽的土豆则会引起茄碱中毒,食用未经处理的鲜黄花菜会因摄入秋水仙碱含量过高而导致中毒,拌制凉菜使用的油若含有蓖麻油可能会引起蓖麻碱中毒,以及绿色蔬菜中若含有作为杀虫剂的鱼藤酮,也可引起中毒。已有研究表明,茄碱的毒性较低,但人只要误食0.2～0.4 g就会出现恶心呕吐、头昏、瞳孔散大和颜面青紫等中毒症状,情况严重时因呼吸衰竭而死亡[1-2];蓖麻碱属于剧毒生物碱,中毒表现为恶心呕吐、血压降低和呼吸困难等[3],摄入0.16 g则可使成人致死;秋水仙碱中毒类似于急性肠胃炎,其中毒症状与砷中毒类似,主要包括喉咙灼热、恶心呕吐、腹泻以及肾衰竭[4],剂量超过0.8 mg/kg就会导致心源性休克[5];鱼藤酮也对人体健康具有一定的危害,主要表现为神经细胞的ATP代谢受阻,延脑中枢先兴奋后抑制,直至呼吸和血管运动中枢出现麻痹。欧盟食品安全局(EFSA)规定甘蓝和黄瓜中鱼藤酮的最大残留限量(MRL)值均为0.01 mg/kg,中国台湾省规定蔬菜中鱼藤酮的MRL值为0.2 mg/kg[6],我国0.5 mg/kg[7],但国内外对其他3种植物毒素的限量标准未作出明确规定。

目前,植物毒素的检测方法主要有气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[8-9]、高效液相色谱法(HPLC)[10-13]和液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)[14-17]等,其他方法如紫外分光光度法[18]、薄层色谱法[19]和化学发光法[20]因灵敏度较低、针对复杂基质的样品无法准确定性等不足而较少使用。有关茄碱、蓖麻碱、秋水仙碱和鱼藤酮的检测对象主要涉及生物检材(血浆、尿液、组织液)、水与食品[3-4,14,21-22],其中食品主要为马铃薯、黄花菜、植物饮料和食用油,且只是对某一种基质单一组分的测定,而关于凉拌菜中多种植物毒素的检测未见报道。基于此,本文采用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)建立了同时快速检测凉拌菜样品中茄碱、蓖麻碱、秋水仙碱和鱼藤酮4种植物毒素的分析方法,为食品中植物毒素的精准定性定量分析提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

凉拌菜(含有黄花菜、土豆丝等蔬菜) 购自石家庄当地超市和农贸市场;蓖麻碱(Ricinine)、鱼藤酮(Rotenone) 纯度>95%,Sigma-Aldrich公司;秋水仙碱(Colchicine)、茄碱(Solanine) 纯度>95%,国药集团化学试剂有限公司;甲醇、乙腈 色谱纯，美国Fisher公司;甲酸 色谱纯，美国Dikma公司;其他试剂 均为分析纯。

1200-6410B高效液相色谱-串联质谱仪(配有电喷雾离子源(ESI)) 美国Agilent公司;AE240电子天平 瑞士Mettler Toledo公司;T-460/H超声清洗器 德国Elma公司;C3I台式离心机 法国Jouan公司;EVAP-12氮吹仪 美国Organomation公司;MS3涡旋振荡器 德国IKA公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 准确称取2 g(精确至0.01 g)凉拌菜样品于50 mL离心管中,加入10 mL正己烷∶二氯甲烷(1∶1,v/v)提取剂,涡旋30 s,振荡提取5 min,以4000 r/min离心5 min,重复上述操作三次,合并提取液,取3 mL提取液在35 ℃下氮吹至近干,用甲醇溶解残渣并定容到1 mL,过0.2 μm滤膜后供HPLC-MS/MS分析。

1.2.2 标准溶液的配制 分别称取适量4种植物毒素标准品,用甲醇配制成1.0 g/L的标准储备液,储存于-20 ℃冰箱中。取适量茄碱、蓖麻碱、秋水仙碱和鱼藤酮标准储备液,用甲醇定容,得到1.0 mg/L的混合标准溶液。用提取的基质空白溶液逐级稀释配成0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 ng/mL的系列混合标准工作溶液。

1.2.3 植物毒素的测定

1.2.3.1 色谱条件 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×50 mm,1.8 μm);柱温:35 ℃;流速:0.2 mL/min;进样量:5 μL。流动相:0. 1%甲酸水-甲醇(10︰90,v/v);等度洗脱。

1.2.3.2 质谱条件 离子源:电喷雾离子源(ESI);扫描方式:正离子扫描;检测方式:多反应监测(MRM);雾化气压力:172.4 kPa;干燥气:N2;干燥气流速:10 L/min;干燥气温度:350 ℃;毛细管电压:4000 V;4种植物毒素的母离子、子离子、碎裂电压(Fragmentor)和碰撞能(CE)见表1。

1.3 数据处理

采用MassHunter数据处理系统(美国Agilent公司)采集数据、命名及积分,Microsoft Excel 2010(美国微软公司)进行统计处理。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

茄碱、蓖麻碱、秋水仙碱和鱼藤酮的结构中含有N、O等杂原子,易结合H+,所以采用ESI正离子模式进行检测。首先,进行全扫描模式(Scan)筛选母离子;其次,通过选择性离子扫描模式(SIM)确定最优碎裂电压;最后,用子离子扫描模式(Product Ion)获得定量、定性离子对,同时优化碰撞能。4种植物毒素的质谱参数见表1。

表1 4种植物毒素的质谱参数Table 1 Mass spectrometric parameters of 4 plant toxins

注:*为定量离子。

2.2 色谱条件的优化

为了提高茄碱、蓖麻碱、秋水仙碱和鱼藤酮的质子化效率,在水相中加入0.1%甲酸。实验比较了有机相为乙腈和甲醇的分离效果、峰形及响应强度。结果显示,当有机相为乙腈时,蓖麻碱与秋水仙碱的峰形较宽。当选择甲醇为有机相时,四种物质的响应信号较高、峰形和分离效果较好。进一步优化流动相比例,最终选择以0.1%甲酸水-甲醇(10∶90,v/v)为流动相,等度洗脱对四种物质进行分析(图1)。

图1 4种植物毒素混合标准溶液(50 μg/L)的总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of 4 plant toxins mixed standard solution(50 μg/L)注:1:茄碱;2:蓖麻碱;3:秋水仙碱;4:鱼藤酮。

2.3 前处理方法的优化

对凉拌菜样品进行加标(10 μg/kg),参照实验方法1.2.1进行样品前处理,本实验对比了乙腈、甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷和氯仿作为提取剂对4种植物毒素的提取效率。结果表明,乙腈、甲醇、乙酸乙酯和氯仿作为提取剂时,4种物质不能同时被提取,且回收率均在35%以下;只有二氯甲烷能够将四种物质同时提取,但是回收率较低,为37.2%～46.8%。另外,二氯甲烷的密度较高,提取剂在下层,菜泥漂浮在上面,植物毒素不利于被提取,所以又在其中加入一定量的正己烷以减小溶剂密度,使提取剂在上层便于提取,并比较了不同体积比的正己烷︰二氯甲烷对4种植物毒素的回收率的影响,如表2所示。当正己烷∶二氯甲烷体积比为1∶1时,茄碱、蓖麻碱、秋水仙碱和鱼藤酮的回收率均可达到70%以上。此外,还比较了萃取次数对4种植物毒素提取效率的影响。实验结果显示,随着萃取次数的增加,提取效率提高。当萃取次数为3次时,茄碱、蓖麻碱、秋水仙碱和鱼藤酮的回收率最好,分别比萃取一次时提高15.5%、17.3%、17.6%和11.7%。

表3 4种植物毒素的线性范围、检出限与定量下限Table 3 Linear relationships,LODs and LOQs of 4 plant toxins

表2 不同体积比的正己烷∶二氯甲烷 对4种植物毒素的回收率的影响Table 2 Effect of different volume ratios of n-hexane and dichloromethane on 4 plant toxins recoveries

2.4 基质效应

基质效应(Matrix Effect,ME)是指基质中的共提取干扰物质影响目标化合物的离子化,对响应信号产生影响。基质效应严重影响HPLC-MS/MS分析的准确性[23]。其计算公式ME(%)=A/B×100[24-25],其中:A为空白样品基质中添加某一浓度待测物响应值,B为在纯溶剂中添加同一浓度待测物的响应值。ME小于100%,为基质抑制效应;ME大于100%,为基质增强效应。实验考察了质量浓度为10、20、50、100 μg/L时4种植物毒素在凉拌菜中的基质效应,得到ME为20.7%～68.6%,表明茄碱、蓖麻碱、秋水仙碱和鱼藤酮这四种物质都存在较大程度的基质抑制效应。因此,本实验采用基质空白溶液稀释标准溶液进行外标法校正,以减小基质效应的影响。

2.5 线性范围、检出限与定量下限

将1.0 mg/L的茄碱、蓖麻碱、秋水仙碱和鱼藤酮混合标准溶液用提取的基质空白溶液逐级稀释,配制成0.5～200 μg/L的标准工作溶液,以各化合物的质量浓度(x,μg/L)为横坐标,相应定量离子对的峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线,得到茄碱、蓖麻碱、秋水仙碱和鱼藤酮的线性方程。以3倍信噪比和10倍信噪比分别计算4种植物毒素在凉拌菜基质中的检出限(LOD,S/N=3)和定量下限(LOQ,S/N=10)。如表3所示,4种植物毒素在0.5～200 μg/L范围内呈良好的线性关系,相关系数(r)均大于0.999;方法的LOD为0.10～0.82 μg/kg,LOQ为0.32～2.72 μg/kg。

2.6 方法回收率与精密度

取凉拌菜样品,分别进行5、25、100 μg/kg 3个浓度水平的加标回收实验,每个水平重复测定7次。由表4可见,4种植物毒素的平均回收率为72.1%～99.8%,相对标准偏差(RSD)为0.3%～8.2%。说明本方法的准确度和精密度可满足凉拌菜中4种植物毒素的分析要求。

表4 4种植物毒素的加标回收率及相对标准偏差(n=7)Table 4 Spiked recoveries and RSDs of 4 plant toxins(n=7)

2.7 实际样品的检测

从超市和农贸市场购买含有黄花菜、土豆丝等蔬菜的10份凉拌菜,采用本方法对茄碱、蓖麻碱、秋水仙碱和鱼藤酮进行检测,4种植物毒素均未检出。检测结果说明本次从超市和农贸市场采集的10份凉拌菜加工得当,未检出目标毒素。尽管如此,仍需全面开展市售凉拌菜中4种植物毒素的监测,并根据监测结果,对食材的加工处理过程加强监管,控制植物毒素残留,以保证食品安全。

3 结论

本文通过对前处理方法、色谱条件和质谱参数的优化,建立了HPLC-MS/MS同时检测凉拌菜中茄碱、蓖麻碱、秋水仙碱和鱼藤酮4种植物毒素的分析方法。4种植物毒素在0.5～200 μg/L范围内线性关系良好,相关系数(r)均在0.999以上,在不同添加水平下的平均回收率为72.1%～99.8%,相对标准偏差RSD为0.3%～8.2%,方法检出限为0.10～0.82 μg/kg,定量限为0.32～2.72 μg/kg。该方法操作步骤简单、定性定量准确、回收率及精密度好,能够满足同步快速分析凉拌菜中4种植物毒素的检测要求。