郭元亨1,吕 哲1,丁子元1,王小艳1,李皓然1,邓莉川1,刘颖慰1,陈 博1,佟 毅

(1.中粮营养健康研究院有限公司,营养健康与食品安全北京市重点实验室, 老年营养食品研究北京市工程实验室,北京 102209; 2.中粮生物科技股份有限公司,玉米深加工国家工程研究中心,吉林长春 130033)

随着人们生活水平提高和生活方式的变化,全球范围内肥胖、糖尿病、“三高”等慢性疾病的发病率逐年增长。2017年国务院办公厅发布的《中国防止慢性病中长期规划》(2017～2025年)呼吁,以健康促进和健康管理为手段,到2020年降低慢性病导致的过早死亡率较2015年降低10%。积极开展慢病防治是推动由疾病治疗向健康管理转变的重要手段,因此,饮食中糖分的“健康摄取”成为新时代的健康课题,其中,低热量甜味剂的开发和应用是最为有效的途径之一。

阿洛酮糖(D-psicose,Psi)是D-果糖(D-fructose,Fru)C-3的差向异构体,甜度相当于蔗糖的70%,热量相当于蔗糖0.3%[1],容积特性及口感与蔗糖相近,且同样能与食物中的氨基酸或蛋白质发生美拉德反应,可作为食药行业中蔗糖的替代品[2-4]。另外,与蔗糖相比,D-阿洛酮糖可同等程度的满足消费者对甜味的味觉需求[5]。研究人员发现,相对于高果糖浆具有引发肥胖和糖尿病的风险,D-阿洛酮糖具有控制肥胖和糖尿病的功效,能明显抑制体重的增加和腹部脂肪的堆积[6-8]。动物实验结果表明,D-阿洛酮糖能够有效降低试验动物体内脂肪积累,并可能减少肥胖所引起的其他并发症[9]。以健康人为研究对象,研究阿洛酮糖对血糖的影响发现,每天摄入超过6.7%总碳水化合物的D-阿洛酮糖,可以明显抑制餐后血糖水平[10]。

图1 制备D-阿洛酮糖的工艺流程图Fig.1 Process flow chart of D-psicose preparation

日本学者Shirai和Kamimura利用大鼠做为研究对象[11],Nishii等利用健康狗做为研究对像[12],验证阿洛酮糖安全性,结果均显示阿洛酮糖无不良影响。韩国希杰第一制糖株式会社于2011年向美国食品药品监督管理局(FDA)申请D-阿洛酮糖的“一般认为安全”(GRAS)认定,于2012年6月得到“没有问题”的答复(GRAS Notice No.GRN000400)。认可甜味剂D-阿洛酮糖可以作为食品添加剂使用。松谷集团于2013年向FDA申请其产品D-阿洛酮糖的GRAS认定,并于2014年6月得到“没有问题”的回复(GRAS Notice No.GRN000498)。该报告总结,人体实验每日摄入31～33 g D-阿洛酮糖是没有任何副作用的。因此,D-阿洛酮糖被归类为一种常规的碳水化合物替代品,且不会构成任何安全问题。

阿洛酮糖的生产通常是以果糖为底物,在D-阿洛酮糖3-差向异构酶的催化作用下生成的[13-15],但D-阿洛酮糖在水溶液中溶解度很大,结晶难度较大。受热容易发生玻璃态变化,难以通过喷雾干燥或者其它加热干燥方法制成干品,限制了D-阿洛酮糖的储存运输,严重制约了D-阿洛酮糖产业的发展。因此,本文将以在乙醇体系中优化D-阿洛酮糖的结晶,以得到D-阿洛酮糖晶体,这对阿洛酮糖产业的发展十分重要。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

果葡糖浆(F90) 中粮生化能源衡水有限公司提供;海藻酸钠 国药集团化学试剂有限公司;基因工程菌 中粮营养健康研究院提供;所有高效液相色谱测定的试剂 均为色谱纯级;实验用水 均为Milli-Q水净化系统制备的超纯水(Millipore,Bedford,MA,USA);其余化学试剂 均为分析纯级。

Centrifuge 5424恒温水浴锅 德国Eppendorf公司;XMTD-6000真空干燥箱 重庆长风生物科技有限公司;TDL-5-A台式离心机 上海安亭科学仪器厂;RE-2002旋转蒸发器 北京神泰伟业仪器设备有限公司;Agilent 1260高效液相色谱 美国Agilent公司;PAL-1手持糖度仪 北京阳光亿事达贸易有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 D-阿洛酮糖的定量分析 配制D-阿洛酮糖标准液(10.0 mg/mL),依次稀释成浓度为10.0、8.0、6.0、4.0、2.0、1.0、0.5及0.25 mg/mL的溶液。使用高效液相色谱系统对测定D-阿洛酮糖标准溶液峰面积,以峰面积(3组平行样取平均值)为纵坐标,以溶液浓度为横坐标绘制标准曲线,并根据标准曲线对所需D-阿洛酮糖样品进行定量分析。色谱条件如下;Agilent 1260系列高效液相色谱系统包括G1311C四元泵,G1316A柱温箱,G1329B自动进样系统和G1236A示差检测器,色谱柱为色谱柱为waters sugar-PakI(10 μm,6.5 mm×300 mm);柱温为80 ℃,RID检测温度为55 ℃,流动相为水,流速为0.4 mL/min。所有样品进样前均使用0.45 μm的微滤膜过滤。

结晶工艺中,结晶率的计算如式(1)所示。

D-psicose recovery=mD-psicose%/(Vsolution×Csolution)×100

此外，大部分用户在洗衣时，往往会纠结洗涤剂究竟该放多少，放多了怕残留，放少了唯恐洗不干净。东芝DGH-117X6DZ凭借超微纳米气泡(UFB)技术的应用，能使用溶媒能高的UFB水，扩散纤维中残留的洗涤剂成分，提高漂洗性能，消除洗涤剂残留，进而呵护家人尤其是萌娃的娇嫩皮肤。

式(1)

式中,mD-psicose表示结晶得到的D-阿洛酮糖干重(g);Vsolution表示初始D-阿洛酮糖溶液的体积(mL);Csolution表示初始糖溶液中D-阿洛酮糖的浓度(mg/mL)。

1.2.2 D-阿洛酮糖溶液制备 通过中试发酵罐培养工程菌细胞,管式离心机(18000 r/min)分离得到细胞,采用海藻酸钠固定细胞[14]。另取F90果葡糖浆,稀释成总糖含量为30%的溶液,通过海藻酸钠固定的细胞催化反应,反应结束后,LX-160离子交换树脂脱除阳离子,D-354树脂脱除阴离子,模拟移动床(Ca型分离介质)分离D-阿洛酮糖(纯度98.0%以上),浓缩备用。工艺流程图如图1所示。

1.2.3 单因素实验 1.2.2节所获得的D-阿洛酮糖。纯度可达干物质重量的98.0%以上。前期研究发现,D-阿洛酮糖溶液的浓度与其密度呈正相关的关系,为方便操作,实验中密度经常作为溶液浓度的间接指标。在单因素实验中,乙醇与糖液比设定为3∶1,结晶温度和时间设定为25 ℃和4 h,分析D-阿洛酮糖溶液的密度在1.05～1.40 g/mL之间波动时对D-阿洛酮糖的结晶率的影响。然后,D-阿洛酮糖溶液的密度设定为1.35 mg/mL,结晶温度和糖液密度设定为5 ℃和1.15 g/mL,研究乙醇D-阿洛酮糖浓缩液比在0.5∶1～7∶1之间变化对D-阿洛酮糖结晶率的影响。再后,D-阿洛酮糖溶液的密度设定为1.35 mg/mL,乙醇与D-阿洛酮糖浓缩液比为4∶1,结晶温度设定为25 ℃,对比结晶时间从1～8 h内变动对D-阿洛酮糖的结晶率的影响。最后,乙醇与D-阿洛酮糖浓缩液比为4∶1,结晶时间和糖液密度设定为5 h 和1.35 g/mL,研究结晶温度在-5～55 ℃之间波动时对D-阿洛酮糖的结晶率的影响。

1.2.4 Box-Behnken(BBD)设计试验 为了优化的D-阿洛酮糖结晶工艺,依据单因素试验结果,采用Box-Behnken(BBD)中心复合设计法进行试验设计[16-18],乙醇与D-阿洛酮糖浓缩液比(X1),结晶时间(X2)和结晶温度(X3)设为自变量,D-阿洛酮糖结晶率(Y)设为响应值。设计三因素三水平的响应面试验(详见表1)。二次回归方程依据公式(2)模拟。

式(2)

其中：Y为因变量,β0,βi,βii,βij分别表示常数项、一次项、二次项和交互项的系数;Xi和Xj表示独立量。

表1 三因素三水平响应面设计(Box-Behnken)Table 1 Experimental design and variables levels for Box-Behnken

1.3 数据处理

本实验所有数据均采用3组平行实验测定值的平均值±标准差表示。使用Design-Expert软件(V.8.0.6,State,Inc,Minneapolis,USA),根据响应曲面法对工艺进行优化。数据进行单因素方差分析(ANOVA)以及回归分析。

2 结果与分析

2.1 D-阿洛酮糖的定量分析

D-阿洛酮糖的高效液相色谱如图2A所示。依据标准溶液的浓度和高效液相色谱测得的峰面积关系绘制标准曲线如图2B所示,所得的回归方程如式所示。

A=470714Csolution+37806

式(3)

图2 D-阿洛酮糖标样的 高效液相色谱图(A)及标准曲线(B)Fig.2 HPIEC-RID chromatograms of mannitol(A)and standard curve(B)

2.2 单因素实验结果

分析D-阿洛酮糖溶液密度、乙醇与糖液比、结晶时间和结晶温度等四个单因素对D-阿洛酮糖结晶率的影响。结果如图3所示。

图3A表明,D-阿洛酮糖溶液的密度达到1.25 g/mL之前,D-阿洛酮糖无法结晶析出。当溶液密度超过了1.25 g/mL之后,D-阿洛酮糖结晶率随糖溶液的密度增加而增加。但在实际生产中,当D-阿洛酮糖溶液的密度达到1.35 g/mL后,若要更进一步的升高浓度,能耗会急骤升高。另外,加热浓缩过程中,随着浓度升高,粘度增大,液体传热性能下降,局部受热现象加剧,美拉德反应促使溶液颜色褐变,影响产品品质。因此D-阿洛酮糖结晶所需的适宜密度设定为1.35 g/mL之间。

图3B显示,在乙醇与D-阿洛酮糖浓缩液比在4∶1之前,随着乙醇比重增加,D-阿洛酮糖的结晶率增高。当乙醇比重超过4∶1,结晶率随着乙醇比重增加而降低。这主要是由于D-阿洛酮糖溶液中含有少量的水,当加入无水乙醇后,无水乙醇与水分子相互作用,进一步降低了自由水的含量,促使D-阿洛酮糖结晶析出[19];当乙醇比例进一步增加时,部分D-阿洛酮糖分子会溶于乙醇中,导致D-阿洛酮糖的结晶率降低。

图3C显示,在前5 h,D-阿洛酮糖的结晶收率随着时间的处长快速增高。5 h之后,D-阿洛酮糖的结晶率随着时间的延长略有增加,但增加速率明显放缓。这是因为,随着D-阿洛酮糖以固态形式结晶析出,液体中的阿洛酮糖逐渐减少,这就导致溶解结晶平衡过程中,结晶速率逐渐降低,溶解速率逐渐加快,最终达到结晶速率和溶解速率相同,结晶率不再增高[19]。从结晶率和时间成本两方面考虑,适宜的结晶时间选在4～6 h。

图3 D-阿洛酮糖溶液密度(A)、乙醇与D-阿洛酮糖浓缩液比(B)、结晶时间(C)和温度(D)对D-阿洛酮糖结晶率的影响Fig.3 Effects of carbohydrate solution density(A),ratio of ethanol to D-psicose(B), crystallizing time(C)and temperature(D)on recovery rate of mannitol

图3D显示,温度在-5～55 ℃之间变化。D-阿洛酮糖的结晶率随着温度增加面升高,当温度超过25 ℃时,温度的增加反而促使D-阿洛酮糖结晶率的降低,当温度达到55 ℃时,溶液中的结晶收率降为零。这种现象的原因可能是在较低的温度条件下,随着温度升高,分子运动加快,溶液粘度降低,有利于D-阿洛酮糖分子相互碰撞,加快D-阿洛酮糖结晶析出。当温度超过临界值时,D-阿洛酮糖在乙醇中的溶液度升高,使得结晶率下降[19]。从图3D的结果表明,D-阿洛酮糖适宜的结晶温度在15～35 ℃之间。

2.3 模型拟合与统计分析

基于Box-Behnken中心复合设计。通过响应面法(RSM)进行工艺优化,实验设计如表2所示。整个设计包含17个实验点,包括12个阶乘点和5个中心点。5中心点用来估算纯误差平方和。结果表明,D-阿洛酮糖的结晶率在52.56%～71.50%之间。

表2 BBD设计表与实测的D-阿洛酮糖结晶率Table 2 Box-Behnken design matrix and response values for D-psicose recovery rate

使用统计软件Design-Expert V.8.0.6对表2实验数据进行分析,并采用多元回归分析,得到自变量X1、X2和X3与因变量Y1之间的模拟回归方程,如公式(4)和(5)所示。

式(4)

式中,Y表示D-阿洛酮糖的结晶率。X1、X2、X3的编码值分别表示乙醇与D-阿洛酮糖浓缩液比,结晶时间(h)和结晶温度(℃)。

表3 对于D-阿洛酮糖结晶率的 响应曲面回归模型的单因素方差分析Table 3 Analysis of variance(ANOVA)for the response surface regression model of D-psicose recovery rate

注:*表示显著性差异,P<0.05;**表示极显著差异,P<0.01。

图4 两因素交互作用的响应面图Fig.4 Response surface diagram of two-factor interaction

2.4 响应曲面及结晶工艺的优化

采用BBD设计和响应曲面分析,研究了三个自变量对D-阿洛酮糖结晶率影响。三维响应曲面图如图4所示。保持三个自变量的其中一个在中间水平,其余两个自变量组成了一系列同心圆或椭圆。这一系列的同心圆或者椭圆表征了变量之间的相互影响是否显著。椭圆曲线表明,相应的变量之间的交互作用对响应值的影响是显著的。而圆形曲线意味着变量之间的交互作用对响应值的影响是不显着的[19-20]。由此可知,乙醇阿洛酮糖浓缩液比与结晶温度,结晶时间与结晶温度的交互作用对响应值的影响是显著的(近似椭圆形)。

通过RSM优化D-阿洛酮糖结晶的最佳工艺参数为:乙醇与D-阿洛酮糖浓缩液比为3.84∶1,结晶温度和结晶时间分别为25.46 ℃和5.42 h。考虑到实际操作条件,乙醇与D-阿洛酮糖浓缩液比设定为3.8∶1,结晶温度设定为25 ℃,结晶时间修正为325 min。在修正的条件下,BBD预测的D-阿洛酮糖结晶率为71.10%。为验证该模型的可信度,进行了3组平行验证实验,平均结晶率为71.58%。总体而言,该模型与预测值相对误差为0.67%,理论预测值与实际测定值吻合度较高,对实际应用具有较的模拟效果。

3 结论

在乙醇溶液体系中结晶D-阿洛酮糖。为获得高结晶率D-阿洛酮糖晶体,用响应曲面法来优化结晶过程中的工艺参数。优化的最佳操作条件为:D-阿洛酮糖溶液的密度为1.35 g/mL,乙醇与D-阿洛酮糖浓缩液的比例为3.8∶1,结晶时间和温度分别为325 min和25 ℃。在此条件下,D-阿洛酮糖的结晶率可达71.58%。此工艺简单易行,操作安全,可为D-阿洛酮糖的结晶产业提供依据。