,2

(1.沈阳工学院生命工程学院,辽宁抚顺 113122; 2.沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳 110866; 3.沈阳师范大学粮食学院,辽宁沈阳 110034)

香蕉皮约占香蕉果实重量的30%～40%,香蕉皮中含有大量的果胶、膳食纤维、维生素等营养物质[1]。此外,香蕉皮中还含有一定量的单宁,单宁是一种多酚类衍生物,具有清除自由基[2]、抑菌[3]等功能,广泛应用于医药、食品、制革[4]及印染工业[5],有极高的研究及应用价值。目前香蕉皮中单宁没有充分利用,相关研究较少[6]。

超声波萃取技术是利用超声波辐射压产生的强烈空化效应、扰动效应和搅拌作用等多级效应,增大物质分子运动频率和速度,增加溶剂穿透能力,从而加速目标成分进入溶剂,促进萃取效果[7-8]。刘细祥等[8]优化提取香蕉皮中单宁工艺,发现超声功率100 W、提取温度55 ℃、料液比1∶25 (g/mL)及提取时间30 min时单宁提取率最大。陈荟芸等[9]得到超声辅助法提取肉桂中单宁最佳工艺:乙醇体积分数50%,料液比1∶20 g/mL,超声功率360 W,提取时间40 min,提取温度40 ℃,单宁得率为41.28 mg/g。超声波法提取甜玉米芯多酚可提高萃取效果,并保持多酚的抑菌性[10]。因此超声波提取天然活性成分可缩短提取时间、提高有效成分的萃取率,避免高温对活性成分的影响。

由于人工合成抗氧化剂可抑制体内代谢酶活性,过量食用会导致畸形、癌变,因此对于替代BHA、BHT、PG和TBHQ在油脂中应用的趋势越来越大[11]。屈恋等[12]发现柠檬桉果实中的单宁纯化物DPPH自由基清除率最大为92.18%,羟自由基清除率最大为74.61%。正丁醇萃取柿木皮单宁提取物含量为0.04%,油脂有很好的抗氧化作用,其抗氧化效果优于VC,并且与VC有协同增效作用[13]。由此看出,植物中单宁是天然抗氧化剂的优质资源。

本实验采用超声波法提取香蕉皮中单宁,并利用响应面法优化提取工艺参数,同时对单宁提取物抗氧化能力及其在大豆油脂加速氧化过程中的抗氧化作用进行研究,确定单宁提取物对油脂的保护率,为香蕉皮中单宁的开发和抗氧化应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

香蕉(北蕉,采购时间2018年6月) 沈阳市家乐福超市;盐酸、磷酸、钨酸钠、磷钼酸、硫酸、无水碳酸钠、单宁酸标准品、硫代硫酸钠、异辛烷、重铬酸钾、碘化钾、冰乙酸、抗坏血酸 分析纯,天津市天力化学试剂有限公司。

ALD210-2R型电子天平 沈阳龙腾电子有限公司;721G型可见分光光度计 上海精科仪器有限公司;KQ-300DE型超声波提取仪 昆山市超声仪器有限公司;GFL-70型鼓风干燥箱 天津市莱伯特仪器有限公司;RE-52A型旋转蒸发仪、SHZ-Ⅲ型循环水真空泵 上海亚荣生化仪器厂;HH-4数控恒温水浴锅 国华电器有限公司;TD5Z台式离心机 湖南凯达科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理 将新鲜的青绿香蕉皮在恒温干燥箱中60 ℃烘干,将其粉碎过40目筛,收集香蕉皮粉密封备用[10]。

1.2.2 超声波法提取单宁 将香蕉皮经过预处理后称量10.0000 g放入烧杯中,加入体积分数60%乙醇并用玻璃棒搅拌均匀,然后进行超声波提取,提取条件为超声波功率300 W,料液比为1∶50 g/mL,超声时间为40 min,乙醇体积分数为60%[14],除去滤渣,收集提取液,用旋转蒸发仪浓缩提取液,再用真空冷冻干燥机冻干浓缩液制备成香蕉单宁提取物样品,然后测定单宁产率,最后将此样品稀释成适当浓度进行抗氧化活性测定。

1.2.3 响应面分析试验设计 根据前期单因素实验结果进行响应面中心组合试验设计,研究各因素对单宁产率的影响规律,并得到超声波萃取的最佳条件。选取超声功率、超声时间、料液比、乙醇浓度为自变量,以单宁产率为响应值,根据中心组合设计原理,设计响应面分析试验见表1。

表1 试验因素水平编码表Table 1 Factors and levels of test

1.2.4 单宁的标准曲线与产率测定 采用Folin-Donis法测定单宁酸标准曲线[15],以吸光度为纵坐标(Y),浓度(mg/mL)为横坐标(x),得到标准曲线方程:y=0.0778x+0.0041,R2=0.9991。单宁产率按照公式(1)计算[10]。

产率(%)=单宁提取物溶液浓度(mg/mL)×溶液体积(mL)/香蕉皮质量×100

式(1)

1.2.5 抗氧化性测定 将1.2.3中得到的单宁提取物配制成浓度为0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mg/mL,VC配制成相同浓度,然后分别对不同浓度单宁提取物和对照物VC的DPPH自由基清除能力[16-17]、超氧自由基清除能力[18]、羟基自由基清除能力[19-20]进行测定,自由基清除率(K)按照公式(2)计算。

K(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100

式(2)

式中:Ac为上述体系中多酚用等体积的乙醇代替测定吸光度值;Ai为上述体系中多酚某浓度时测定的吸光度值;Aj为上述体系中DPPH溶液用等体积乙醇代替测定吸光度值(去除样品本底颜色)。

1.2.6 Schaal烘箱加速氧化试验和油脂抗氧化值测定 采用烘箱加热加速氧化试验(Schaal Oven Test)将一级大豆油150 g置于带盖无色透明的玻璃瓶中,然后在大豆油中分别加入其质量分数0.02%、0.04%和0.06%单宁提取物,混合均匀后,盖子轻微盖上,空白对照不添加单宁提取物,同时放入(62±1) ℃的精密高温试验箱中连续加热氧化144 h,每隔12 h对其进行晃动,并改变装载油样玻璃瓶在恒温箱中的位置[21]。每隔48 h取出适量氧化的大豆油,并参照GB 5009.227-2016进行过氧化值分析测定。

式(3)

式中:η为单宁对油脂的保护率[22](%);POV初为未对油脂进行强化氧化时过氧化值(mmol/kg);POV末1为添加单宁提取物油脂强化氧化后的过氧化值(mmol/kg);POV末2为未添加单宁提取物油脂强化氧化后的过氧化值(mmol/kg)。

表3 回归与方差分析结果Table 3 Results analysis of regression and variance

注:*:表示具有显著性P<0.05;**:表示具有极显著性P<0.01。

1.3 数据分析

所有试验均进行三次重复试验。数据采用Design expert 8.06统计软件进行分析。不同处理间的数据采用SPSS 17.0软件中多重比较方法,显著水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 香蕉皮单宁产率的响应面试验结果

以超声功率A、超声时间B、料液比C、乙醇浓度D为自变量,单宁产率Y为响应值,优化试验设计和响应值如表2。分别进行16组析因试验,5组中心试验,通过试验优化降低试验误差。

表2 响应面试验方案及结果Table 2 Design and results of response surface method

通过Design expert 8.06 得到以下方程:

Y=1.85+0.039A-0.051B+0.019C+0.17D+0.12AB-0.047AC-0.082AD+0.017BC+0.052BD-0.032CD-0.071A2-0.064B2-0.088C2-0.09D2。

按照显著性检验,料液比对单宁产率影响显著(P<0.05),A、B、AB、AC、AD、BD、CD、A2、B2、C2、D2对目标值的影响均为极显著(P<0.01)。表3反映通过F检验得到因素贡献率为:B>A>C>D(超声时间>超声功率>料液比>乙醇浓度)。

2.2 最佳单宁提取条件的确定及验证

响应面分析法得到的最佳条件如下:超声功率428.74 W,超声时间40 min,料液比1∶41.83 g/mL,乙醇浓度65.51%,单宁产率1.87%±0.021%。优化取整后响应面分析法得到的最佳条件:超声功率430 W,超声时间40 min,料液比1∶42 g/mL,乙醇浓度66%,在最佳条件下进行3次平行试验,单宁产率平均值为1.87%,这说明响应值符合回归预测值,并且模型能预测单宁产率的实际条件。

2.3 香蕉皮中单宁的抗氧化性分析

不同浓度的单宁提取物和VC对DPPH自由基清除率影响如图1所示,随着单宁提取物浓度增加,DPPH清除率逐渐增加然后趋于稳定,这是因为单宁中邻位酚羟基也会发生自氧化过程,产生醛和酮类物质,自氧化过程限制自由基清除效果[23]。单宁浓度1.5 mg/mL时,DPPH清除率最大(80.02%)。单宁提取物和VC半抑制浓度分别为0.300、0.395 mg/mL,说明单宁提取物对DPPH自由基具有较高的清除能力,其清除DPPH自由基能力来自于供氢能力[24]。

图1 单宁与VC浓度对DPPH自由基清除能力影响Fig.1 Effect of tannin and VC concentration on the scavenging ability of DPPH free radical

不同浓度的单宁提取物和VC对超氧自由基清除率影响如图2所示,随着单宁提取物浓度增加,超氧自由基清除率逐渐增加然后趋于平稳。单宁浓度1.5 mg/mL时,超氧自由基清除率达到最大(54.52%)。单宁提取物和VC半抑制浓度分别为1.185、0.859 mg/mL,说明单宁提取物对超氧阴离子自由基的清除能力较低。

图2 单宁与VC浓度对超氧自由基清除能力影响Fig.2 Effect of tannin and VC concentration on the scavenging ability of superoxide free radical

不同浓度的单宁提取物和VC对羟基自由基清除率影响如图3所示,随着单宁提取物浓度增加,羟基自由基清除率逐渐增加,单宁浓度1.5 mg/mL时,羟基自由基清除率最大(61.24%)。随着VC浓度增加,VC对羟基自由基清除率与单宁提取物有相同的趋势,并且单宁提取物和VC半抑制浓度分别为0.730、0.767 mg/mL,说明单宁提取物对羟基自由基具有较高的清除能力。

图3 单宁与VC浓度对羟基自由基清除能力影响Fig.3 Effect of tannin and VC concentration on the scavenging ability of hydroxyl radicals

香蕉皮单宁属于植物多酚,其酚羟基数目都较多,并具有典型的邻位酚羟基结构,因为邻位酚羟基具有很强的还原性,极易发生氧化反应生成醌类物质,特殊的分子结构赋予植物多酚很好的抗氧化性[23]。自由基结构上含有未配对电子而具有极高的氧化活性,单宁的浓度与自由基清除能力呈显著正相关[25],单宁中邻位酚羟基能够提供氢离子,作为抗氧化剂和供氢体,阻断自由基链反应,反应原理为:F-OH+R·→F-O·+RH[26-27]。

2.4 香蕉皮中单宁对大豆油的抗氧化性的影响分析

单宁提取物对油脂过氧化值影响如图4所示,随着单宁提取物浓度增加,过氧化值明显降低,单宁提取物添加量0.02%、0.04%、0.06%三组油脂过氧化值都显著低于空白对照组(P<0.05),过氧化值是油脂氧化初级阶段的重要指标[28],说明单宁在油脂中起到抗氧化作用。添加三组单宁提取物中添加量0.04%时,大豆油在加速氧化过程中过氧化值最低,抗氧化效果最佳。同时说明单宁提取物超过0.04%,抗氧化能力降低。因为油脂被氧化后生成大量的自由基,形成自由基链式反应,加速油脂氧化酸败。由2.3结果可知,单宁能够清除超氧阴离子和羟自由基,并能与油脂氧化产生的自由基相结合,产生稳定化合物,减缓或终止链式反应,从而降低过氧化值。然而随着加速氧化时间延长,单宁易受到高温作用的影响,自身发生氧化,降低自由基清除能力,促进了油脂的氧化作用,此结果与高瑀珑等[29]研究结果相同。同时天然抗氧化剂在含量较低时具有较好的抗氧化作用,但含量较高时自身发生氧化反应产生大量自由基起到助氧化作用。

图4 单宁提取物对油脂过氧化值影响Fig.4 Effects of tannin extracts on lipid peroxidation注:a～c表示不同处理组间相同氧化时间对应的 过氧化值在P<0.05上差异显著;图5同上。

单宁提取物对油脂保护率的影响如图5所示,单宁提取物浓度0.04%、0.06%两组油脂保护率显著高于单宁提取物添加量0.02%(P<0.05),并且单宁提取物浓度0.04%处理组油脂保护率最大,此结果与过氧化值结果一致。单宁提取物添加量0.02%、0.04%、0.06%三组油脂保护率都是随着氧化时间增加先增大后减小,单宁提取物在96 h内对大豆油的抗氧化作用逐渐增加,可以有效降低氢过氧化物的形成。

图5 单宁提取物对油脂保护率的影响Fig.5 Effects of tannin extracts on the lipid protection

3 结论

超声辅助响应面法提取香蕉单宁的优化条件:超声功率430 W,超声时间40 min,料液比1∶42 g/mL,乙醇浓度66%,在优化条件下单宁产率最大值为1.87%。单宁提取物能清除DPPH、超氧和羟基自由基,并且单宁提取物对DPPH和羟基自由基的半抑制浓度(IC50)都低于VC阳性对照组,其中清除DPPH自由基的IC50值最低,表明单宁提取物清除DPPH自由基能力较强。单宁提取物添加量0.04%时,大豆油在96 h过氧化值最低,油脂保护率最高,表明大豆油抗氧化效果较好,随着氧化时间进一步延长,抗氧化能力降低。因此单宁具有一定的抗氧化能力,对单宁提取物进一步分离纯化,阐明单宁分离物抗氧化机理,可为单宁作为天然抗氧化剂应用到油脂和蛋白等食品中奠定理论基础。