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(1.青海大学农林科学院,青海西宁 810016; 2.青海省青藏高原农产品加工重点实验室,青海省农林科学院,青海西宁 810016; 3.农业部农产品质量安全风险评估实验室(西宁),青海西宁 810016)

青稞又称裸大麦,是青藏高原地区的独有物种资源,也是藏区人民的主要口粮[1]。黑青稞是一类极其珍贵的青稞种质资源[2-4],具有多种益于人体健康的矿质元素[5],如锌、铜、铁等,同时黑青稞具有高蛋白质、高膳食纤维、高维生素、高β-葡聚糖[6]等特点,富含独特的花青素类物质[7-10],具有较强的消除体内自由基和抗氧化作用[11-13],能够延缓衰老、预防癌症[14]。当前,青稞的加工方式主要以粮油制品、发酵青稞酒为研究重点,同时针对β-葡聚糖[15-16]、青稞多肽等功能成分也有大量研究,但针对混菌型青稞发酵技术的研究则非常少。而目前对于黒青稞的研究也主要集中在农艺性状[17]、营养成分测定[18]、功能成分分离提取[19]等方面,其加工综合利用研究相对较少,大多集中在黑青稞酒、黑青稞醋、黑青稞米、黑青稞片等产品,对于以固态黑青稞为研究对象对其发酵过程中生化成分变化的研究更是几乎空白,亟需加强黑青稞发酵产品的研究及开发,提高我国黑青稞资源的利用率。而固态发酵是一种成本较低、利用率较高、污染较少的生产方式,不仅能够实现黑青稞资源的广泛利用,还能提高原料的营养及功能性价值,具有广阔的应用前景。

当前,乳酸菌是公认的、安全的益生菌,其发酵制品深受大众喜爱,且乳酸菌具有改善肠道微生态环境,增强免疫力和消除机体炎症等多种生理活性。但由于其自身淀粉酶和蛋白酶相对不发达,难以直接有效利用基质中的营养成分,单独发酵黑青稞成品品质低、风味差。前期试验发现,乳酸菌R1和乳酸菌R5发酵性能均较高,且发酵产物品质均较好,但两株菌区别在于混合发酵后黑青稞制品品质不同,R1混合发酵后制品乙醇含量高,R5混合后制品含酸高、乙醇低,对于不同类型的黑青稞发酵制品,可以选择不同的菌株进行混合,为黑青稞制品类型的选择提供依据。因此,本研究选择固态发酵的传统菌种—米根霉和乳酸菌混合发酵,探究黑青稞在混菌固态发酵过程中生化成分的变化规律,以达到乳酸菌固态发酵黑青稞的目的。以期为科学判断黑青稞发酵产品终点和控制发酵过程提供了技术参数,也为进一步开发黑青稞功能性产品提供新的思路和研究方向。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乳酸菌R1、R5由青海省青藏高原农产品加工重点实验室分离西藏灵菇乳得到,经鉴定均为假肠膜明串珠菌;黑青稞(昆仑17号) 青海省农林科学院作物育种栽培研究所提供;米根霉发酵剂 安琪酵母股份有限公司;葡萄糖标准品(纯度≥95.0%) 合肥博美生物科技有限责任公司;其他试剂 均为分析纯。

pHS-3C型精密酸度计 上海仪电科学仪器股份有限公司;LDZX-75KB型立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;SW-CJ-2型双人净化工作台 苏州净化设备有限公司;AL204型分析天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;N4S 紫外可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司;LRH-150型生化培养箱 上海齐欣科学仪器有限公司;THZ-300C型恒温振荡器 上海一恒科学仪器有限公司;BCD-649WE型冰箱 青岛海尔股份有限公司;DL-5M型高速台式冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的配制 MRS培养基:蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母提取物5 g、K2HPO42 g、柠檬酸二铵2 g、乙酸钠5 g、葡萄糖20 g、吐温80 1 mL、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g、琼脂15 g、蒸馏水1 L,调节pH到6.2～6.4,121 ℃下灭菌30 min。

1.2.3 黑青稞发酵工艺流程 黑青稞挑选、去杂→清洗→浸泡→沥干→蒸煮→冷却→接菌→发酵→成品

挑选、清洗:选用黑青稞饱满、去除泥土、沙尘,清洗后用纱布沥干;浸泡:室温下浸泡24 h;蒸煮:常压下蒸煮20 min。

1.2.4 固体发酵

1.2.4.1 乳酸菌单独发酵 称取一定量的黑青稞于500 mL烧杯中,向其中加入体积比为1∶2的蒸馏水,并在室温下浸泡24 h。用纱布沥干水分后,置于蒸锅中常压下蒸煮20 min,并分装于250 mL三角瓶中,冷却后按5%(v/w)接种量分别接入乳酸菌R1和R5,置于30 ℃下培养箱中发酵,每隔12 h取样。

1.2.4.2 米根霉单独发酵 称取一定量的黑青稞于500 mL烧杯中,向其中加入体积比为1∶2的蒸馏水,并在室温下浸泡24 h。用纱布沥干水分后,置于蒸锅中常压下蒸煮20 min,冷却后按0.5%(w/w)的接种量接入米根霉,置于30 ℃下培养箱中发酵,每隔12 h取样。

1.2.4.3 乳酸菌与米根霉混合发酵 称取黑青稞于500 mL烧杯中,加入体积比为1∶2的蒸馏水,在室温下浸泡24 h。用纱布沥干水分后,置于蒸锅中常压下蒸煮20 min,冷却后接入0.5%(w/w)的米根霉,并分别接入5%(v/w)的乳酸菌R1和R5,置于30 ℃下培养箱中发酵,每隔12 h取样。

1.2.5 生化成分的测定 发酵取样后,分别测定黑青稞在发酵过程中pH、总酸含量、乙醇含量、还原糖含量、氨基酸态氮含量等成分,明确单独发酵、混合发酵的变化规律。

笔者相信，以村落民俗志为基础的乡村研究，在当今中国重述“亚洲”、重写“世界史”和“全球史”的学术热潮中，不仅没有过时，而且不可或缺。毕竟，体察中国国情，理解中国道路，提炼中国话语，仍要以“在村落里研究”[注][美]克利福德·格尔茨：《文化的解释》，韩莉译，译林出版社，1999年，第29页。 的乡土中国学术实践为立足点。

1.2.5.1 pH测定 取10 g发酵样品,将其捣碎并加入100 mL无CO2的蒸馏水,边浸泡边摇动15 min,将其过滤,取滤液采用pHS-3C型精密酸度计直接测定[21]。

1.2.5.2 总酸的测定 采用0.1 mol/L NaOH滴定法测定发酵乳的酸度[22]。

式中:X为样品总酸含量的质量浓度,%;C为NaOH标准溶液的浓度,mol/L;V为滴定消耗NaOH的体积,mL;V0为样品稀释液总体积,mL;VI为滴定时吸取样液的体积,mL;m为样品质量,g;K为换算系数,选用乳酸,折算系数为0.09。

1.2.5.3 乙醇含量测定 采用重铬酸钾氧化比色法。以乙醇为标准品制作标准曲线[23]。根据标准曲线可得回归方程:y=0.5566x+0.01138,R2=0.9983。其中y为样品吸光度A;x为样品中乙醇含量(mg/mL)。

1.2.5.4 还原糖含量测定 采用3,5-二硝基水杨酸比色法[22]。以葡萄糖为标准品制作标准曲线。根据标准曲线可得回归方程:y=3.9771x-0.0138,R2=0.9961。式中:y为样品吸光度A;x为样品中葡萄糖含量(mg)。

1.2.5.5 氨基酸态氮含量测定 甲醛滴定法[22]。

式中:X1为氨基酸态氮含量,g/100 g;V1为待测液加入甲醛后滴定至pH9.2时NaOH的消耗量,mL;V2为空白样加入甲醛后滴定至pH9.2时NaOH的消耗量,mL;V3为试样稀释液取用量,mL;V4为试样稀释液定容体积,mL;m为样品质量,g;0.014为1 mL NaOH标准溶液(C=1 mol/L)相应的氮的含量,g。

1.2.6 感官评分 采用评分法进行感官评定,以发酵得到的黑青稞产品的外观(20分)、香气(30分)、口感(40分)、质地(10分)为评定指标,组织6名(3男3女)经过基础培训的人员对黑青稞发酵制品进行评分,取平均值,评分标准见表1。

表1 黑青稞发酵制品感官品质评分标准Table 1 Sensory evaluation standard of fermented black highland barley

1.3 数据处理

所有实验均重复3 次。数据用Design-Expert 8.06进行分析。

2 结果与分析

2.1 黑青稞发酵过程中pH的变化

黑青稞发酵过程中的pH与发酵菌株生长繁殖和代谢产物的积累密切相关。由图1可知,当两株乳酸菌R1、R5单独发酵黑青稞时,0～12 h黑青稞pH迅速下降,R1、R5发酵黑青稞的pH分别降低至(4.70±0.01)、(4.37±0.22),之后随着发酵时间的延长其pH变化趋于稳定;而米根霉单独发酵黑青稞时,在0～24 h,其pH下降迅速,其后pH稳定在4.41～4.64范围内。但从图1可知在整个发酵过程中R5单独发酵的黑青稞其pH始终低于R1、米根霉单独发酵的结果,说明R5产酸能力与R1、米根霉相比较强。

将两株乳酸菌R1、R5分别与米根霉进行混合发酵黑青稞,由图1可知,随着发酵时间的延长其pH均呈现下降趋势。0～12 h时R1+米根霉混合发酵黑青稞其pH迅速下降,之后趋于稳定;而在0～48 h时R5+米根霉混合发酵黑青稞其pH下降迅速,48 h其pH为(4.17±0.06),其后趋于稳定,且在整个发酵过程中,R5+米根霉发酵的黑青稞与菌株单独发酵及R1+米根霉混合发酵相比,其pH最低,说明R5+米根霉混合发酵产酸能力最强,这可能是由于R5本身产酸能力较高,在混合发酵中其产酸能力占优势,同时米根霉酶解产生的物质能够促进R5发酵产酸,使整个发酵更完全。

图1 黑青稞发酵过程中pH的变化Fig.1 Change in pH of fermented black highland barley during fermentation

2.2 黑青稞发酵过程中总酸含量的变化

黑青稞发酵过程中总酸含量的变化如图2所示。由图2可知,随着发酵时间的延长,黑青稞的总酸含量均呈现逐渐增加趋势。0～12 h,两株乳酸菌R1、R5及米根霉单独发酵黑青稞其总酸含量增加迅速,24 h时总酸含量已达到1.49%±0.13%(R1)、1.98%±0.04%(R5)、1.94%±0.05%(米根霉),其后随着发酵时间的延长其总酸含量趋于稳定,总酸含量变化规律与pH变化正好相反,同时R5总酸含量高于R1、米根霉,符合上述三株菌pH变化趋势,R5产酸能力与R1、米根霉相比较强。

由图2可知,混合发酵黑青稞过程中其总酸含量也均呈现上升趋势,0～48 h时,R1+米根霉、R5+米根霉混合发酵的黑青稞其总酸含量增加缓慢,48 h后随着发酵时间的延长其总酸含量迅速升高,两组混合发酵菌株发酵黑青稞其总酸含量明显高于三株单独发酵菌株。另外,R5+米根霉混菌发酵得到的总酸含量最高,60 h时其总酸含量就已达到5.08%±0.04%,这可能是由于米根霉本身具有较高的酶系,能够将黑青稞的淀粉分解为小分子碳源物质,同时乳酸菌R5本身具有较强的产酸能力,能够直接利用这些物质,使得整个发酵更为充分,产酸较多。此结果说明添加乳酸菌R5能够显著增强其黑青稞发酵过程中总酸含量,能够改善黑青稞发酵制品风味。

图2 黑青稞发酵过程中总酸含量的变化Fig.2 Change in total acidity of fermented black highland barley during fermentation

2.3 黑青稞发酵过程中乙醇含量的变化

黑青稞发酵过程中乙醇含量的变化如图3所示。由图3可知,随着发酵时间的延长,黑青稞发酵过程中乙醇含量均先上升后趋于稳定。菌株单独发酵时,在0～36 h,R1发酵黑青稞其乙醇含量增加,其后随着发酵时间的延长其乙醇含量趋于稳定,36～72 h乙醇含量在0.45～0.53 mg/g之间;而R5在0～48 h随着发酵时间的增加乙醇含量增加,48 h时乙醇含量已达到(2.53±0.22) mg/g,其后乙醇含量趋于稳定;米根霉在0～24 h大量产生乙醇,24 h时已达到(7.85±0.02) mg/g,其后乙醇含量基本达到稳定,其产乙醇含量明显高于两株乳酸菌。在菌株单独发酵黑青稞过程中,米根霉代谢产乙醇含量最高,这可能与米根霉自身的糖化酶有关,能够高效利用黑青稞中的淀粉,达到高效乙醇发酵。

图3 黑青稞发酵过程中乙醇含量的变化Fig.3 Change in alcohol content of fermented black highland barley during fermentation

混合发酵时,在0～24 h,两组混合发酵得到的黑青稞其乙醇含量增加迅速,其后随着发酵时间的延长其乙醇含量仍处于上升趋势,但较为缓慢。48 h时,R1+米根霉、R5+米根霉发酵得到的黑青稞制品其乙醇含量分别为(9.23±0.33)、(8.47±0.39) mg/g;60 h后R1+米根霉混合发酵的黑青稞产乙醇含量相较于菌株单独发酵及R5+米根霉混合发酵最高,达到(9.40±0.41) mg/g;而R5+米根霉混菌发酵的黑青稞其乙醇含量在整个发酵过程中均低于米根霉单独发酵及R1+米根霉混合发酵。从以上结果可知,米根霉与黑青稞发酵产乙醇密切相关,在米根霉单独发酵时,其乙醇含量就已达到较高水平,而添加R1进行混合发酵更能促进发酵产乙醇,使黑青稞发酵制品更具风味。但在R5+米根霉混合发酵时,其乙醇含量较低,这可能是由于R5本身具有较高的产酸能力,而产乙醇能力相对较弱,在与米根霉混合发酵时,能够高效利用小分子碳源物质产生更多的酸,致使乙醇含量相对较低,这对于研制低酒精黑青稞发酵制品更为有利。

2.4 黑青稞发酵过程中还原糖含量的变化

黑青稞发酵过程中还原糖含量的变化如图4所示。由图4可以看出,三株菌株单独发酵时,随着发酵时间的增加,两株乳酸菌单独发酵黑青稞的还原糖含量呈现逐渐降低趋势,且在0～48 h乳酸菌R5发酵黑青稞的还原糖含量明显低于R1,但48 h后,两株菌发酵黑青稞的还原糖含量均趋于稳定，且还原糖含量较为接近,48 h时分别为(0.22±0.01)(R1)、(0.20±0.01) mg/g(R5)。而米根霉单独发酵黑青稞时,其还原糖含量随着发酵时间的增加呈现出先增加后略下降趋势,在48 h达到最大,为(6.94±0.22) mg/g。两株乳酸菌发酵黑青稞其还原糖含量均下降,可能是由于菌株利用黑青稞中的碳源物质进行增菌和代谢产生乙醇及其他代谢产物,当发酵时间达48 h,其后菌株发酵能力受发酵产物及环境的影响,其还原糖含量趋于稳定。而米根霉发酵黑青稞其还原糖含量先增加后略下降,可能是由于米根霉具有较为发达的酶系,在发酵过程中能够有效利用黑青稞中的淀粉成分并代谢产生还原糖,但当发酵时间过长,其整个发酵体系不利于米根霉的生长及发酵,还原糖含量略有下降。

图4 黑青稞发酵过程中还原糖含量的变化Fig.4 Changes in reducing sugar content of fermented black highland barley during fermentation

混合发酵时,随着发酵时间的增加,黑青稞的还原糖含量均呈现出先增加后略下降趋势。在0～24 h,R1+米根霉及R5+米根霉混合发酵得到还原糖逐渐增加,24 h时分别达到了(5.00±0.06)、(5.59±0.37) mg/g,36 h后两种混合发酵得到的还原糖含量较为接近且逐渐趋于稳定;两种混合发酵与三株菌单独发酵相比,其还原糖含量明显高于两株乳酸菌R1、R5,但却低于米根霉单独发酵黑青稞的结果,这可能是因为米根霉本身具备较高的糖化酶,分解产生还原糖含量较多,当混合发酵时米根霉产生的还原糖利于其他菌株的发酵产酸及其他代谢产物,使得混合发酵的还原糖含量低于米根霉单独发酵的结果,但混合发酵产生的物质更为丰富,且适宜的还原糖含量有利于增加黑青稞发酵制品的甘甜口感,同时能够延长发酵制品的贮藏时间[24]。而乳酸菌糖化分解能力差,还原糖含量低。因此,与菌株单独发酵黑青稞相比,混合发酵从口感和营养角度更具优势。

2.5 黑青稞发酵过程中氨基酸态氮含量的变化

黑青稞发酵过程中氨基酸态氮含量的变化如图5所示。由图5可以看出,黑青稞发酵过程中随着发酵时间的增加,其氨基酸态氮含量均呈现逐渐增加的趋势。菌株单独发酵时,三株菌发酵的黑青稞其氨基酸态氮含量明显升高,0～48 h内R1发酵的黑青稞其氨基酸态氮含量显著高于R5、米根霉。在48 h时,氨基酸态氮含量分别达到了0.087(R1)、0.059(R5)、0.081 mg/g(米根霉)。混合发酵时,0～24 h,R5+米根霉发酵的黑青稞其氨基酸态氮含量与R1+米根霉混菌组合相比增加迅速,且R5+米根霉发酵得到的氨基酸态氮含量高于R1+米根霉混合发酵的结果;而当发酵时间超过36 h,两种混合发酵得到的氨基酸态氮含量接近,且在60 h时其氨基酸态氮含量基本一致,其氨基酸态氮含量分别为(0.11±0.002)(R1+米根霉)、(0.11±0.010) mg/g(R5+米根霉)。将三株菌单独发酵的结果与两种混合发酵相比,混合发酵得到的氨基酸态氮含量明显高于菌株单独发酵的结果。氨基酸态氮含量变化主要是由于微生物利用自身的蛋白酶系降解黑青稞蛋白,一部分小分子的氮源供微生物自身所用,另一部分分解成为游离氨基酸[25],丰富黑青稞发酵制品的风味和口感,提高人体对黑青稞蛋白的利用率[26]。因此,混合发酵黑青稞制品更优于菌株单一发酵的结果。

图5 黑青稞发酵过程中氨基酸态氮含量的变化Fig.5 Changes in ammonium nitrogen content of fermented black highland barley during fermentation

2.6 混合菌株发酵黑青稞的感官评分

在前期研究过程中发现,R1和R5单独发酵的黑青稞其乙醇含量及还原糖含量较低,同时其发酵制品表现出明显的酸味且发酵香味较淡,分别对米根霉单独发酵、R1+米根霉混菌发酵、R5+米根霉混菌发酵进行感官评定,结果如图6所示。由图6可知,不同发酵时间下得到的黑青稞发酵制品其感官性质存在差异。随着发酵时间的延长,其感官评分呈现先增加后降低趋势。在发酵初期0～24 h,黑青稞发酵制品呈现质地较硬,无发酵风味及香味;在发酵36～48 h,其感官品质显著提高,黑青稞发酵制品呈现明显的发酵香味、香甜可口、软硬适中,品质较佳;在发酵后期60 h后,感官评分较低,黑青稞发酵制品表现出具有较重的酸味、涩味,质地较为软烂。综合比较,混合发酵得到的黑青稞发酵制品及感官品质高于传统米根霉单一发酵的制品,且R5+米根霉混合发酵48 h时,黑青稞发酵制品品质最佳、口感最优。

图6 混合菌株发酵黑青稞的感官评分Fig.6 Sensory evaluation of fermented black highland barley fermented by mixed strains during fermentation

3 结论

本研究通过对2株乳酸菌R1、R5与1株米根霉单独及混合发酵黑青稞进行生化成分动态研究,结果表明,3株菌株单独发酵过程中,R5发酵的黑青稞其pH明显下降,最低达到4.32±0.01,且总酸含量显著高于其余两株菌,最终达到2.52%±0.12%,说明R5发酵产酸能力较强;而米根霉发酵的黑青稞其还原糖含量及乙醇含量明显高于R1、R5,最高分别达到(6.94±0.22)、(9.19±0.49) mg/g;R1、R5发酵得到的氨基酸态氮含量较为接近且高于米根霉,最终分别达到(0.10±0.01)、(0.11±0.01) mg/g。与单一菌株发酵黑青稞相比,混菌发酵能显著提高黑青稞发酵制品的营养品质并改善其风味,其中R5+米根霉混合发酵的黑青稞制品在发酵过程中pH下降较快、产酸较多,pH由5.65±0.08降低至4.16±0.08,总酸含量由0.48%±0.03%增加至7.16%±0.03%,乙醇含量较低,最终仅为(8.25±0.35) mg/g,而氨基酸态氮含量与其他发酵结果接近,另外其感官品质优于其他发酵,48 h评分最高,达到(86±0.89)分,适宜发酵制备低酒精、高营养型黑青稞发酵制品。而R1+米根霉混合发酵的黑青稞制品产酸较少,但其乙醇含量最高,最终达到(9.80±0.60) mg/g,适宜发酵低酸、高酒精黑青稞发酵制品。综合考虑,最终确定混合固态发酵48 h时其黑青稞制品营养品质及感官特性最佳。根据发酵黑青稞产品的品质及风味要求,可选择适宜的混合发酵菌株,该结果可为开发黑青稞产品工业化生产奠定基础。