，*3,

(1.北华大学药学院,吉林吉林 132013; 2.北华大学医学院,吉林吉林 132013; 3.北华大学吉林省中药DNA指纹检测技术科技创新中心,吉林吉林 132013; 4.北华大学医学技术学院,吉林吉林 132013; 5.吉林雷宁科技有限公司,吉林吉林 132013)

“民以食为天,食以安为先”,食品安全已经成为世界性公共卫生问题。从欧洲的“马肉风波”事件[1]到中国的“鸭肉变羊肉”、“驴肉掺假门”事件,以及层出不穷的“牛肉膏事件”等系列事件,均在不同程度上损害了消费者健康。在人们生活水平不断提高的今天,肉类逐渐成为人们餐桌上的主角,其质量的好坏尤其是肉类及肉类产品的真实性直接关系到每一个人的身体健康和生命安全,其次以低价肉类伪装成高价肉类,影响着肉类食品产业的健康发展。因此肉类食品动物源性成分的鉴定刻不容缓。但是随着现代肉类食品工业的飞速发展、掺假手段的多样性,普通消费者难以通过感官和性状对食品中动物源性成分进行鉴定。

20 世纪80年代,国内外开始对肉制品掺假进行研究,早期的肉品鉴定方法主要基于脂肪酸和蛋白质水平[2],主要是电泳技术[3-4]、免疫学技术[5]、光谱技术[6]。但上述方法在实际应用中存在不同程度的局限性,干扰鉴定的结果。随着分子生物学技术中PCR 技术的不断发展和完善,以PCR为基础的DNA分析方法已成为国内外鉴别肉类物种常见的方法,如Calvo等[7]通过应用PCR反应实现了对加工和未加工食品和饲料中的牛肉和牛源物质成分的检测。陈思秀等[8]针对驴源性成分研制出DNA检测试剂盒。Girish等[9]、Hamzah等[10]和Imaizumi等[11]证明了细胞色素b(Cytochrome,Cytb)基因、D-loop、16S rDNA和12S rDNA等基因序列均可用于肉类物种的鉴定。Soares等[12]通过实时荧光PCR测定法定量检测肉制品中的大豆。Liliana等[13]建立了加工食品中马肉成分的实时荧光PCR检测方法。唐修君等[14]建立了基于实时荧光PCR法检测畜禽肉中鸡源性成分的研究方法。这些研究虽在一定程度上为动物源性检测提供了一种常规、有效的方法,但由于掺杂物种多样性,导致只针对单一标靶基因的PCR反应很难一次性进行全部检测。实时荧光定量PCR技术对引物、探针、使用仪器和操作人员等要求高,使其应用受到限制[15]。而以mtDNAcytb为靶基因建立多物种同步检测的多重PCR技术,可提高检测效率与检测通量,如今已成为研究的热点[16-17]。

mtDNA系母系遗传,基因组结构高度保守,一级结构有很大的差异,适合于物种的鉴定研究[18]。cytb基因是线粒体内编码蛋白质的基因,进化速度适中,是作为动物源性成分鉴定的理想分子遗传标记物之一[18-20]。本研究选择不同动物mtDNAcytb基因作为靶基因,根据cytb基因多态性位点的差异,设计物种特异性引物,建立用于同时检测掺入牛肉中猪肉、鸡肉动物源性成分的多重PCR分析体系,实现对肉类食品中掺假动物成分的来源快速、灵敏、高通量地分析,以期肉类市场监督部门提供的科学和高效的检测技术,保障人们的健康,保障肉类产业的健康发展。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜的牛肉、猪肉、鸡肉、马肉、羊肉、驴肉 均由长春食品药品检测中心提供;鸭肉、狗肉、兔肉等 购自本地某超市;2×Taq PCR MasterMix、100 bp DNA Ladder、20 mg/mL蛋白酶K、10 mg/mL RNase A 天根生物科技有限公司;GelRed Nucleic Acid Gel Stain 美国Biotium公司;琼脂糖 西班牙BIOWEST公司;Tris-HCl、EDTA-Na2美国Genview公司;SDS Biosharp公司;NaAc结晶、异丙醇、无水乙醇 分析纯,天津市永大化学试剂有限公司。

H-2050R高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司;LX-100手掌型离心机 江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司;9700 GeneAmp PCR System 美国Per-kin-Elmer公司;DYY-8B稳压稳流电泳仪 北京市六一仪器厂;凝胶成像系统 Eppendorf公司;HH.S精密恒温水浴锅 江苏金坛市医疗仪器厂;Q6000超微量紫外-可见分光光度计 美国Quawell公司;ZF-90型紫外透射反射分析仪 上海嘉鹏科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 提取肉样DNA 基于SDS法进行改良[21]:样品均为鲜品,用生理盐水洗涤3次后,去除结缔组织和脂肪,储存在-20 ℃备用,防止DNA降解。称取前处理样品0.1 g,放入离心管中,剪碎,加入P1(0.01 mol/L Tris-HCl 500 μL、0.01 mol/L EDTA 500 μL、10% SDS 80 μL、20 mg/mL蛋白酶K 20 μL、10 mg/mL RNase A 2 μL),混匀后56 ℃水浴震荡2 h,加入P2(饱和NaAc)500 μL,颠倒混匀,12000 r/min离心10 min。取上清液,加入等体积P3(异丙醇)混匀,-20 ℃以下放置1 h,12000 r/min离心10 min,弃去上清液。加入P4(70%乙醇)洗沉淀2次,室温干燥沉淀后,加入P5(灭菌ddH2O)溶液100 μL,置-20 ℃保存备用。

1.2.2 检测DNA的纯度和浓度 使用Q6000美国Quawell超微量紫外-可见分光光度计,分别测定每个样品提取DNA溶液的浓度和纯度,以检测其质量。取1 μL微量的核酸样品进行加样(可重复测量,样品体积在0.5～2.0 μL范围内),5 s检测完成,自动计算并显示260/280比值、样品浓度。

1.2.3 引物的设计 从NCBI数据库中下载牛种属cytb基因序列(MH714784.1)、猪种属cytb基因系列(AF136554.1)、鸡种属cytb基因序列(AF028795.1),利用MEGA7软件对基因序列进行序列同源性比较分析,寻找特异性SNP位点[22],利用Primer Premier 5.0设计物种特异性引物,使正反向引物3′端位均位于SNP位点上,调整退火温度在50～55 ℃范围内,并使用Oligo 7软件分析避免引物间出现二聚体、发夹结构或引发错配的情况[23]。设计的特异性引物序列(见表1)由生工生物工程(上海)有限公司合成。

表1 特异性引物序列及产物大小Table 1 Specific primer sequences and product size

1.2.4 多重PCR反应及条件优化 多重PCR反应总体积为50 μL,包括:2×Ta Mix 25 μL,不同物种的上游引物(5 μmol/L)、下游引物(5 μmol/L)0.2～1 μL,DNA模板(100 ng/μL)0.5 μL,其余用灭菌ddH2O补齐。将PCR反应管置PCR仪,扩增程序:94 ℃预变性2 min,循环反应30次(94 ℃ 30 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s),延伸72 ℃ 5 min。以此条件为基础,对多重PCR反应的退火温度(50～55 ℃)、循环数(25～35个)和不同引物的添加量(1～0.2 μL,以0.2 μL进行梯度递减)进行反应体系的条件优化。

图1 不同退火温度下琼脂糖凝胶的检测结果Fig.1 Agarose gel test results at different annealing temperatures注:M:100 bp DNA Ladder;1:牛肉;2:猪肉;3:鸡肉;N:空白;图2同。

琼脂糖凝胶浓度为1%,胶中加入核酸凝胶染色剂GelRed(终浓度0.075 μL/mL);PCR结束后,取反应溶液5 μL上样,100 bp DNA Ladder上样量为5 μL,1×TBE缓冲液,80 V,1 h后,在紫外分析仪上检视并拍照。

1.2.5 引物特异性检测 使用牛的引物,加入采用1.2.1方法提取的牛、猪、鸡、马、羊、驴、鸭、狗、兔DNA模板进行PCR扩增;使用猪的引物,以牛、猪、鸡、马、羊、驴、鸭、狗、兔DNA模板进行PCR扩增;使用鸡的引物,以牛、猪、鸡、马、羊、驴、鸭、狗、兔DNA模板进行PCR扩增,鉴定引物的特异性。并通过将单一物种DNA加入混合引物中进行引物特异性的验证实验。

1.2.6 灵敏性测试 将实验提取的牛肉、猪肉、鸡肉的DNA溶液,运用DNA核酸蛋白分析仪定量并稀释至100 ng/μL。将牛肉DNA、猪肉DNA、鸡肉DNA进行10倍梯度稀释至0.1 pg/μL,作为模板进行扩增,以此来考察牛肉、猪肉、和鸡肉多重PCR方法的灵敏度。

1.3 数据处理

PCR扩增产物凝胶电泳图谱均由紫外透射反射分析仪进行成像分析,使用 Photoshop CS6进行处理。

2 结果与分析

2.1 肉类DNA模板的质量

将肉类DNA进行浓度和纯度测定,反复测量3次,采用SPSS Statistics V17.0软件进行统计学分析,浓度测量差值不超过0.01,说明该仪器测量结果精确稳定。A260/A280均值约为1.88±0.2,纯度均在1.80～2.00范围内,说明该方法提取获得的DNA 样品基本无蛋白质污染、纯度高(见表2)。

表2 提取的肉类DNA的纯度和浓度检测结果Table 2 Detection results of purity and concentration of extracted meat DNA

2.2 PCR反应条件优化

图2 不同循环数的琼脂糖凝胶检测结果Fig.2 Agarose gel test results at different cycle numbers

2.2.1 最适退火温度和循环数的确定 分别在退火温度为50、52、55 ℃和不同循环参数的条件下对牛、猪、鸡进行PCR扩增,根据琼脂糖凝胶电泳结果(图1a～图1c)表明牛和鸡引物的退火温度范围较宽,牛的引物在149 bp处出现特异性条带，鸡引物在554 bp处出现特异性条带。但是猪的引物仅在退火温度为52 ℃时,于261 bp处出现清晰单一的特异性条带,50和55 ℃退火温度下猪的引物出现非特异性扩增条带。所以以单重PCR为基础,确定多重反应的最适退火温度为52 ℃。在25、30、35个循环参数条件下对牛、猪、鸡进行鉴别时,结果(图2a～图2c)表明25个循环PCR条带亮度浅,35个循环PCR结果中猪出现非特异性扩增。考虑到DNA提取质量和浓度的区别以及DNA可能存在降解问题,选择多重PCR反应循环参数为30个。

2.2.2 最适引物量的确定 在多重PCR反应中各个引物之间的比列对反应有严重影响。加入等量的引物,引物之间存在相互抑制,可能出现某一物种没有条带的现象。而通过改变反应中各种引物加入量,使得PCR扩增结果不同物种均出现特异性的条带。以牛、猪引物量为1 μL为基础,梯度减少鸡引物加入量(1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 μL)对多重反应的影响,根据结果图3确定鸡的上下游引物用量为0.2 μL;在此基础上考察猪的引物量,图4表明猪引物用量为0.8、1 μL时,条带清晰,考虑到引物间相互影响,确定猪引物加入量为0.8 μL;以此对牛的引物量进行摸索,当牛引物量为0.6 μL时,多重PCR条带均清晰且无非特异性扩增(见图5)。确定鸡、猪、牛最适引物量分别为0.2、0.8、0.6 μL。

图3 多重PCR中鸡的引物加入量结果Fig.3 Results of primer addition of chicken in multiplex PCR注:M:100 bp DNA Ladder;1:鸡引物1.0 μL; 2:鸡引物0.8 μL;3:鸡引物0.6 μL; 4:鸡引物0.4 μL;5:鸡引物0.5 μL;N:空白。

图4 多重PCR中猪的引物加入量结果Fig.4 Results of primer addition of pigs in multiplex PCR注:M:100 bp DNA Ladder;1:猪引物1 μL; 2:猪引物0.8 μL;3:猪引物0.6 μL; 4:猪引物0.4 μL;5:猪引物0.5 μL;N:空白。

图5 多重PCR中牛的引物加入量结果Fig.5 Results of primer addition of cattles in multiplex PCR注:M:100 bp DNA Ladder;1:牛引物1 μL; 2:牛引物0.8 μL;3:牛引物0.6 μL; 4:牛引物0.4 μL;5:牛引物0.5 μL;N:空白。

2.3 混合肉样的多重PCR检测

将提取的3个目标物种的肉类DNA、两两等比例混合肉样DNA、3个物种等比例混合肉样DNA,对多重PCR反应体系进行考察。电泳图显示在相应位置的出现目标条带,检测结果与预期结果一致(图6)。

图6 多重PCR检测结果Fig.6 Results of multiplex PCR注:M:100 bp DNA Ladder;1:牛肉;2:猪肉;3:鸡肉; 4:牛肉和猪肉;5:牛肉和鸡肉;6:猪肉和鸡肉; 7:牛肉、猪肉和鸡肉;N:空白。

2.4 引物特异性验证结果

电泳结果如图7所示,使用单一引物加入多个物种DNA模板反应时,均在设计位置观察到特异性条带,未见明显非特异性扩增,且与其他动物源性物种均无交叉反应。从图8中可以看出,用牛、猪、鸡的引物组分别对马、羊、驴、鸭、狗、兔肉DNA进行扩增均未出现特异性条带,表明每个物种引物特异性良好。

图7 引物特异性结果Fig.7 Results of primer specificity注:M:100 bp DNA Ladder;1:牛的引物+混合DNA; 2:猪的引物+混合DNA;3:鸡的引物+混合DNA; 4:牛、猪、鸡的引物+混合DNA;N:空白。

图8 引物特异性验证结果Fig.8 Verification results of primer specificity 注:M:100 bp DNA Ladder;1:马肉DNA+牛、猪、鸡引物; 2:羊肉DNA+牛、猪、鸡引物;3:驴肉DNA+牛、猪、鸡引物; 4:鸭肉DNA+牛、猪、鸡引物;5:狗肉DNA+牛、猪、鸡引物; 6:兔肉DNA+牛、猪、鸡引物;N:空白。

2.5 灵敏性考察结果

将100 ng/μL牛肉DNA、猪肉DNA、鸡肉DNA依次进行10倍梯度稀释,考察方法的灵敏性。由图9～图11所示,使用多重PCR体系进行检测时,最低浓度为100 pg/μL时,仍可检测出目标物种的特异性扩增条带。

图9 牛PCR灵敏性的检测结果Fig.9 Detection results of PCR sensitivity in cattles注:M:100 bp DNA Ladder;1:牛100 ng/μL;2:牛10 ng/μL; 3:牛1 ng/μL;4:牛100 pg/μL;5:牛10 pg/μL; 6:牛1 pg/μL;7:牛0.1 pg/μL;N:空白。

图10 猪PCR灵敏性的检测结果Fig.10 Detection results of PCR sensitivity in pigs注:M:100 bp DNA Ladder;1:猪100 ng/μL;2:猪10 ng/μL; 3:猪1 ng/μL;4:猪100 pg/μL;5:猪10 pg/μL; 6:猪1 pg/μL;7:猪0.1 pg/μL;N:空白。

图11 鸡PCR灵敏性的检测结果Fig.11 Detection results of PCR sensitivity in chicken注:M:100 bp DNA Ladder;1:鸡100 ng/μL;2:鸡10 ng/μL; 3:鸡1 ng/μL;4:鸡100 pg/μL;5:鸡10 pg/μL; 6:鸡1 pg/μL;7:鸡0.1 pg/μL;N:空白。

3 讨论与结论

牛肉是世界第三消耗肉品,约占肉制品市场的25%,含有极高的营养价值,但是市场上常有将低廉肉类代替或掺入牛肉制品的事件出现,严重损害消费者权益,是我国食品质量安全面临的严峻问题之一[24]。本实验成功建立一种能够同时检测牛肉中掺入猪、鸡源性成分的多重PCR检测方法,能快速、准确的筛查食品中动物来源成分。

本实验通过采用SDS-PK酶法提取DNA避免试剂毒害,提取DNA的浓度高、纯度佳,并通过统计学分析表明该方法提取DNA的效果稳定,保证DNA模板的质量。从而减少样本交叉污染造成假阴性或假阳性的可能性。引物设计是整个研究的关键步骤,直接关系到目标物种能够实现成功检出。本实验选取牛种属、猪种属、鸡种属mtDNAcytb基因序列作为靶基因,利用MEGA7软件对基因序列进行序列同源性比较分析,寻找特异性SNP位点,利用Primer Premier 5.0设计物种特异性引物,使正反向引物3′端位均位于SNP位点上,并调整退火温度均在在50～55 ℃范围内。能有效避免引物之间相互反应,形成引物二聚体,同时也避免引物间的相互干扰对目标基因的扩增产生影响。

本研究通过单重PCR反应为基础,通过引物的特异性实验,筛选出三对引物共同的退火温度为52 ℃,在52 ℃时,扩增出牛源性成分的的特异性片段149 bp,猪源性成分的特异性片段261 bp,鸡源性成分的特异性片段554 bp,均没有非特异性扩增。在52 ℃时,对三对引物加入量进行优化,因为在多重PCR扩增时,在一个反应体系中,加入等量的引物(1∶1∶1),引物之间存在相互抑制,会出现某一物种没有条带的现象,本实验通过反复筛选,调整引物量鸡、猪、牛分别为0.2、0.8、0.6 μL时,扩增出来的特异性条带清晰明亮,无非特异性扩增条带的出现。并且将模板DNA从微克及稀释到皮克级时,仍可检测出目标物种的特异性扩增条带。并且以不同动物来源的混合DNA(包括牛、猪、鸡)为模板分别扩增牛、猪、鸡引物,结果分别在149、261、554 bp处出现特异性扩增条带,无非特异性扩增条带出现;然后以牛、猪、鸡的混合引物来扩增不同动物来源的模板DNA(牛、猪、鸡除外)来进行验证,均未出现扩增条带,表明三对引物的特异性好。

本研究建立的动物源性多重PCR方法,可以同时、特异、准确、快速鉴定出牛源性、猪源性、鸡源性成分。同时检测最低限为100 pg/μL。该方法提高了普通PCR的筛选通量,另外,与现行标准所使用的实时荧光定量PCR技术相比,本研究对试验试剂以及试验仪器要求均较低,便于推广,且检测成本较低。对于相关监管部门的检测具有较大的应用价值,可在食品监管中实现普及应用。本研究为一次完成更多个物种的掺假检测提供理论基础。