邓俊琳3,李晚谊,*,于丽娟2,陈 建3,李 宏2,夏 陈3,田 浩2,李智敏

(1.云南省农业科学院药用植物研究所,云南昆明 650205; 2.云南省农业科学院农产品加工研究所,云南昆明 650221; 3.四川省农业科学院农产品加工研究所,四川成都 610066)

余甘子为大戟科叶下珠属植物(PhyllanthusemblicaL.),又名油甘子、牛甘子、鱼木果等,是一味重要的传统民族药材,其味苦、甘、酸、涩,性凉,主治血热血淤、消化不良、腹胀、咳嗽、喉痛等症[1]。卫生部于2002年将余甘子列入“既是食品又是药品的物品名单”之中。作为联合国卫生组织指定在全世界推广种植的三种保健植物之一,余甘子广泛分布于热带、亚热带,在我国主要分布于海南、福建、广东、云南等地。余甘子果实含有大量的多酚类、维生素C,黄酮类、多糖等物质,具有抗氧化、抗癌、抗病毒、降血脂、抗缺氧等作用[2]。其中,多酚类化合物作为植物重要的次生代谢产物,在种子萌发、植物生长和发育、抗霜冻和防御病虫害等过程中均起到重要作用[3-4]。同时多酚类化合物对人类健康也有诸多益处,比如没食子酸(Gallic acid)、柯里拉京(Corilagin)、鞣花酸(Ellagic acid)均具有抗氧化[5-7]、抑菌作用[5,8-9],诃子鞣酸(Chebulagic acid)具有抗血管生成[10]、改善乙醇诱导的胃损伤功效[11]等作用。

中药材种类与性质各异,干燥方式及干燥温度通常会影响药材中的活性成分[12]。目前常用的干燥方式主要有晒干、阴干、热风干燥、真空冷冻干燥,以及新型的微波、远红外、惰性粒子流化床等干燥技术。其中,自然干燥(晒干和阴干)易受天气变化的影响,干燥不均匀,且长时间大面积接触自然界的昆虫[13];热风干燥较少受到受天气、气候等自然因素,便于根据不同药效特性控制干燥温度,其操作简单,生产成本低,适合工业化规模化生产,但因物料大面积暴露在氧气和高温条件下,其易发生氧化和热降解,从而导致产品质量下降[14];真空冷冻干燥又称冷冻干燥,被认为是一种具有高提取率且可以保护多酚类化合物结构不被破坏的有效干燥方式[15],但是真空冷冻干燥设备昂贵、耗能大、投资成本高,在企业大规模生产中往往受到诸多限制[16];其他新型的干燥技术均存在设备要求高、生产成本高等问题,还未被大规模的广泛应用。

目前对余甘子的研究多集中在活性成分、药理功能等方面,但对其品质有较大影响的干燥方式研究甚少,尤其干燥方式对多酚类化合物的影响未见报道。本文拟对干燥方式(热风干燥:较常用于规模化生产;冷冻真空干燥:被认为是加工高质量食品的最佳干燥方法)以及干燥温度(冻干、40、60、80和100 ℃)进行研究,考察其对余甘子醇提物中没食子酸、柯里拉京、鞣花酸和诃子鞣酸4种活性成分的影响,以及对余甘子总多酚含量和抗氧化活性(ABTS自由基清除能力和DPPH自由基清除能力)的影响,以期为余甘子的合理加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

余甘子 2018年3月采收于云南省大理市宾川县,经云南省农业科学院药用植物研究所李晚谊教授鉴定并确认,样品存档于四川省农业科学院农产品加工研究所功能食品研究室;没食子酸、柯里拉京、鞣花酸、诃子鞣酸标准品 色谱纯,纯度≥98%,北京索莱宝科技有限公司;乙腈、甲醇 色谱纯,美国MREDA公司;甲酸、福林酚、AlCl3、没食子酸、水溶性VE等 均为分析纯,成都市科龙化工试剂厂;0.22 μm微孔滤膜 美国MREDA公司。

FW-100高速万能粉碎机 北京科伟永兴仪器有限公司;TD-4Z型台式低速离心机 四川蜀科仪器有限公司;KH2200DE型数控超声波清洗器 昆山禾创超声仪器有限公司;ELX-800型号酶标仪 美国伯腾仪器有限公司;1260型高效液相色谱仪 美国Agilent公司;UV-6100型号紫外分光光度计 上海元析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 供试样品溶液的制备 挑选新鲜无损的余甘子果,用刀去核得果肉,分别采用冷冻真空干燥,40、60、80、100 ℃热风干燥(干燥过程中每隔1 h称重,当相隔两次重量之差≤2%时即认定为已烘干),打粉,过60目筛备用。

称取余甘子果肉粉末1.00 g,加入8 mL 80%甲醇,40 ℃超声40 min(超声频率40 kHz输入功率200 W),6000 r/min离心10 min,收集上清液,再提取2次,合并3次上清液并定容到25 mL。0.22 μm微孔滤膜过滤,作为高效液相色谱检测的待测液,其余样品用于检测总多酚含量和抗氧化活性。

1.2.2 余甘子果肉醇提物HPLC定量分析 色谱柱:Poroshell 120 PFP柱(4.6 mm×100 mm,2.7 μm);DAD检测器,检测波长:254、280 nm;柱温:30 ℃;流速:0.8 mL/min;进样量5 μL;流动相:1%的甲酸水溶液(A)+乙腈(B)。梯度洗脱:0～5 min,B梯度变化3%～6%;5～10 min,B 6%～8%;10～25 min,B 8%～20%;25～30 min,B 20%～30%;30～35 min,B 30%～70%;35～38 min,B 70%～90%。

标准品溶液的制备:没食子酸、柯里拉京、鞣花酸、诃子鞣酸标准品20 mg,分别用甲醇溶解并定容至10 mL作为标准品母液。以二倍稀释法用甲醇将各标准品母液配制成一系列浓度梯度的标准品溶液,高效液相色谱待测。以没食子酸、柯里拉京、鞣花酸、诃子鞣酸的质量浓度(μg/mL)为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线,得线性方程如表1所示。

样品中多酚单体的含量计算公式如下:

多酚单体含量(mg/g)=待测液中多酚单体浓度×稀释倍数×样品定容体积/提取质量/1000

1.2.3 总多酚含量测定方法 采用福林酚法[17]。取10 μL待测液(稀释适当倍数),加入20 μL福林酚,混匀,室温反应5 min,再加入160 μL 5% Na2CO3,混匀,避光反应1 h,于酶标仪上765 nm检测。以没食子酸质量浓度(μg/mL)为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程:Y=0.0029X+0.0263(R2=0.9982,线性范围4.30～275 μg/mL)。

表1 没食子酸、柯里拉京、鞣花酸、诃子鞣酸标准品的标准曲线(n=6)Table 1 Ctandard curve of gallic acid,corilagin,ellagic acid and chebulagic acid(n=6)

样品中总多酚含量计算公式如下:

总多酚提取量(mg/g)=待测液浓度×稀释倍数×样品定容体积/提取质量/1000

1.2.4 ABTS+自由基清除能力测定 取20 μL待测液(稀释适当倍数),再加20 μL超纯水(样品时改为80%甲醇),加160 μL ABTS自由基溶液(K2S2O8溶液和ABTS溶液混合配制ABTS自由基溶液,最终混合液中K2S2O8浓度为2.45 mmol/L,ABTS浓度为7 mmol/L,在室温下混合液避光孵育16 h,再用pH=7.0的PBS缓冲液稀释混合液,使混合液734 nm处吸光值为0.7±0.0.2)溶液,避光反应6 min,于酶标仪734 nm处测定吸光值。以水溶性VE的质量浓度(μg/mL)为横坐标,吸光值为纵坐标,制作标准曲线[18]。得回归方程:Y=-0.006X+0.471(R2=0.997,线性范围0～47.5 μg/mL)。

ABTS+自由基清除力(mg/g)=待测液浓度×稀释倍数×样品定容体积/提取质量/1000

1.2.5 DPPH自由基清除能力测定 取20 μL待测液(稀释适当倍数),加入80 μL超纯水(样品时改为80%甲醇),再加100 μL DPPH(0.2 mmol/L)溶液,混匀,避光反应30 min,于517 nm处测它的吸光值。以水溶性VE的质量浓度(μg/mL)为横坐标,清除率(%)为纵坐标,制作标准曲线[19]。得回归方程:Y=0.9428X-0.4202(R2=0.997,线性范围13～104 μg/mL)。

清除率计算公式为:

清除率(%)=(1-Ax/A0)×100

式中:Ax:样品的吸光度值;A0:乙醇代替样品时的吸光值。

DPPH自由基清除力(mg/g)=待测液浓度×稀释倍数×样品定容体积/提取质量/1000

1.3 数据处理

所有数据均为3次重复试验的平均值,应运Microsoft Excel 2007和SPSS 20.0对数据进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 HPLC测定不同干燥温度下余甘子果肉中没食子酸、柯里拉京、鞣花酸和诃子鞣酸的含量

如图1所示,没食子酸、柯里拉京、鞣花酸、诃子鞣酸在30 min内均得到较好分离,样品溶液色谱图中4个目标峰,保留时间与标准品溶液的4个色谱峰保留时间一致。

图1 多酚化合物标准品和余甘子醇提样品的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of standard pdyphenol compounds and aloohol extracted samples in the P. emblica注:1:没食子酸,2:柯里拉京,3:诃子鞣酸,4:鞣花酸;A:80 ℃干燥的余甘子,B:40 ℃干燥的余甘子,C:冷冻干燥的余甘子,D:60 ℃干燥的余甘子,E:100 ℃干燥的余甘子,F:标准品。

由表2可知,随着干燥温度的升高,4种化合物含量呈现显著增加的趋势,100 ℃烘干的余甘子中4种化合物含量均为最高。推测可能原因有以下四点:其一,高温造成植物组织细胞破碎促进多酚类物质的释放[19];其二,植物在遭受紫外辐射、高温、机械伤害等逆境时,苯丙烷代谢途径中的关键酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性会迅速升高,同时积累大量酚酸、类黄酮物质,以提高植物的抗逆性[20];其三,高温破坏了原本与多糖、多肽等结合的结合态酚,使得释放出更多的游离态多酚[19];其四,这4种多酚化合物对高温有较强的耐受,其结构不易被破坏。通常认为物料大面积暴露在氧气和高温条件下易发生氧化和热降解,从而导致产品质量下降,而冷冻干燥在低温条件下进行,对物料的结构、形状及营养成分破坏最小[21],因此冷冻干燥也被认为是一种具有高提取率且可以保护多酚类化合物结构不被破坏的有效干燥方式[15]。但在本研究中,与热风干燥相比较,冷冻干燥样品中4种多酚化合物提取率均为最低,这可能与高温促进游离态酚的释放,以及这4种化合物的耐热性有关。

表2 各温度干燥处理后余甘子醇提物中4种多酚化合物的含量(mg/g)Table 2 Contents of 4 phenolic compounds in the alcohol extract of P. emblica under different drying temperature(mg/g)

注:小写字母代表不同温度干燥的余甘子样品中多酚化合物含量的差异显著,P<0.05;表3同。

2.2 干燥温度对余甘子果肉总多酚含量和抗氧化活性的影响

由表3可知,40 ℃时热风干燥处理下,余甘子中总多酚含量最低(149.89 mg/g);随温度升高,总多酚逐渐增加,当温度达到80 ℃时,总多酚含量最高(200.92 mg/g),100 ℃热风干燥后余甘子总多酚含量略有下降(但差异不显著)。冷冻干燥和60 ℃热风干燥获得的余甘子总多酚含量无显著差异。热风干燥可能一方面促进植物组织细胞破碎和共价键的断裂,促进更多酚类物质的释放[19],另一方面可能导致某些内源酶失活,从而阻止酚类物质被氧化[22]。但当热风干燥的温度过高,可能破坏某些多酚化合物的结构,进而导致总多酚的含量下降。

表4 余甘子醇提物中4种多酚化合物、总多酚和抗氧化活性的相关性分析Table 4 Correlation analysis of 4 phenolic compounds,total polyphenols and antioxidant activity in the alcohol extract of P. emblica

注:*代表显著相关,P<0.05;**代表极显著相关,P<0.01。

本次ABTS试验和DPPH试验的结果较一致,余甘子抗氧化活性最弱均为40 ℃干燥的样品,最强为80 ℃干燥的样品。此外,本实验中抗氧化活性随着干燥温度的变化趋势与总多酚的变化趋势也基本一致,这表明醇提液的抗氧化活性与总多酚含量有密切关联。多酚是氢或电子供体,具有酚类游离基中间体的共振非定域作用和没有适合分子氧进攻的位置,不会引起新的游离基或因连锁反应而被迅速氧化[23],因此具有抗氧化作用。

表3 余甘子醇提物中总多酚含量和抗氧化活性(mg/g)Table 3 Contents of total polyphenols and antioxidant activity in the alcohol extract of P. emblica(mg/g)

2.3 相关性分析

2.3.1 多酚化合物间相关性分析 相关性分析显示(表4),没食子酸、柯里拉京、鞣花酸、诃子鞣酸的含量之间呈现极显著(P<0.01)正相关。研究表明,没食子酸经莽草酸途径代谢产生:莽草酸在莽草酸脱氢酶作用下生成3-脱氢莽草酸,3-脱氢莽草酸烯醇化后在3-脱氢莽草酸脱氢酶作用下生成没食子酸[24]。鞣花酸是没食子酸的二聚衍生物,没食子酸经脱氢、异构化、聚合、烯醇化等一系列反应后生成鞣花酸[25]。柯里拉京与诃子鞣酸的代谢途径有待进一步研究。

2.3.2 多酚化合物与抗氧化活性的相关性分析 由表4可知,本研究证实余甘子醇提物总多酚含量与ABTS+自由基清除力极显著正相关(P<0.01)。研究表明,多酚抗氧化活性的强弱不仅与总多酚的含量有关,还与其种类和组成有关[26]。相关性分析表明,ABTS+自由基清除力与余甘子醇提物中诃子鞣酸呈极显著正相关(P<0.01),与柯里拉京呈显著正相关(P<0.05)。本次试验中,余甘子醇提液的DPPH自由基清除力虽与总多酚含量随干燥温度变化趋势一致,但并未表现出显著相关性。

3 结论

研究不同干燥方式和不同干燥温度处理的余甘子中4种多酚化合物和总多酚含量、抗氧化活性,结果表明，与冷冻干燥相比,热风干燥处理的余甘子样品其4种多酚化合物含量和总多酚含量更高,抗氧化活性更强。此外,随着干燥温度的升高,4种多酚化合物含量逐渐增加,100 ℃时含量均达到最高;余甘子中总多酚含量和抗氧化活性逐渐增强,80 ℃时总多酚含量最高、抗氧化活性最强。综合来说,80 ℃热风干燥更利于余甘子中多酚类化合物的释放,且不会降低其抗氧化活性。

余甘子作为我国的传统民族药材,含有丰富的生物活性物质以及诸多的生理功效。本文仅对冷冻真空干燥和热风干燥对余甘子醇提液中的4种多酚化合物含量及醇提液的抗氧化活性进行了研究,对于余甘子加工过程中的指导是远远不够的,其干燥方式和干燥温度对其它活性成分以及功效的影响还有待进一步研究。