刘仁杰,梁珊,李哲,朴春红

(吉林农业大学 食品科学与工程学院，吉林 长春,130118)

芽孢杆菌是广泛存在于植物中的一种内生菌。内生菌是指在整个生长周期中一直存在于植物的根、茎、叶和花朵等部位[1]，不会对宿主植物表现出任何外部病症甚至对植物本身有益的菌株[2]。芽孢杆菌为好氧或兼性厌氧菌，易产生内生芽孢。芽孢壁厚而含水量低具有多层外壁，对光照、热和辐射等都具有较强抵抗力[3]。芽孢杆菌菌体呈杆状，大小为(0.3～2.2) μm×(2.1～7.0) μm，鞭毛典型侧生，形成的内生孢子为抗热型[4]。芽孢杆菌属的建立是根据形态特征，即经典分类法确立，根据芽孢的形状(卵型或球型)以及其在菌体或芽孢囊的位置，芽孢杆菌可分为3大类：群I，孢囊不显著膨大，芽孢椭圆或柱形，中生到端生，革兰氏阳性；群II，椭圆形芽孢，孢囊膨大，芽孢中生到端生，革兰氏阳性、阴性或可变;群III，孢囊膨大;芽孢通常球形，端生到亚端生，革兰氏阳性、阴性或可变[5]。常见的芽孢杆菌有蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌和产气芽孢杆菌等。枯草芽孢杆菌与蜡样芽孢杆菌存在于空气、土壤中，极易于食品接触。对于大豆作物而言，枯草芽孢杆菌是一种植物内生菌，与食品的加工、生产及储存过程密不可分，难以避免。而其他令我们闻而色变的芽孢杆菌如昆虫病原菌苏云金杆菌(B.thuringiensis)，人畜病原菌炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)、蕈状芽孢杆菌(B.mycoides)、韦氏芽孢杆菌(B.weihenstephanensis)，也广泛存在于外部环境中[6]。

芽孢杆菌可以产生内孢子，对不利环境有较强抵抗力，可能在多种食品保质期内萌发，引起食品腐败变质和疾病的传播。蜡样芽孢杆菌在意外摄入量>103CFU/g时，1～6 h内可以引起呕吐、腹泻；在8～16 h可在小肠内形成热不稳定性肠毒素，导致严重腹痛及水样腹泻[7]。近几年，蜡状芽孢杆菌开始作为益生素加入到食品和饲料中，作为一种有益微生物促进植物生长、防治病虫害[8]，但对这些菌株进行安全性评价是非常必要的。产气荚膜梭状芽孢杆菌可以引起人和动物组织毒性和胃肠道疾病，起病急、病程发展迅速，作用于空肠及回肠，以腹痛、腹泻、腹胀、便血、呕吐、发热为主要中毒症状[9],这与金黄色葡萄球菌中毒症状相似，不利于病症的诊治[10]，引起肠道病理性病变及坏死[11-12]，严重时会导致消费者急性中毒死亡[13]，且常规抑菌剂如乳酸链球菌素、山梨酸盐、苯甲酸及壳聚糖等抑制作用不明显。枯草芽孢杆菌虽然不会对人体产生严重的毒害作用，但是其迅速繁殖会产生感官上的不良感受。

芽孢可以存活于经过巴氏杀菌的婴儿配方乳粉中，在经过冲泡后，室温条件下放置8 h，即可以产生105CFU/g的病原菌，严重危害婴幼儿的健康，降低婴幼儿食品安全性[14]。中温好氧芽孢杆菌广泛存在于原料奶中，在经过超高压瞬时杀菌后仍然可以在牛奶中生长萌发，菌落数可较快达到105CFU/mL，严重影响奶制品的品质并缩短其货架期，成为奶制品行业的一大难题[15]。在乳品工业中，发现一些耐低温的蜡状芽孢杆菌和韦氏芽孢杆菌，在6 ℃甚至是更低的条件下繁殖，并产生肠毒素引起食物中毒[16]。芽孢可在一切适宜条件下生长，并快速繁殖，严重影响食品安全。目前芽孢杆菌被许多国家认定为一种最常检出的微生物，成为食品检测的必检项目。本文就芽孢杆菌的杀灭方法和杀灭机理进行综述。

1 芽孢杆菌的杀菌方法研究进展

1.1 热杀菌法

热杀菌法主要包括巴氏杀菌法、超高温瞬时杀菌和高压灭菌法等。热杀菌技术在食品工业中应用广泛，热杀菌的本质是用燃料或电阻加热在食品外部加以热能，将热能转移到食品内部，从而达到杀菌和钝化酶的目的[17]。但热杀菌过程中高温会导致食品色泽、风味的改变和营养物质的损失。对于芽孢杆菌来说，孢外壁、芽孢衣和皮层共同组成的细胞外壁厚且结构丰富，常规热传递难以作用于核心部位，达不到有效杀灭的目的[18]，常与其他杀菌方法混合使用增强杀菌效果。高温杀菌会使食品的口感、色、香、味以及营养成分发生严重劣变，降低商业价值。对于热能的消耗也严重增加了产品的生产成本，因此热杀菌法越来越不受消费者和生产者的欢迎。

1.2 高压杀菌法

高压杀菌法有高静压法和高压脉冲电场法。高静压杀菌技术是将100～1 000 MPa的静态液体压力施加于食品上并保持几秒钟到几十分钟，起到杀菌、破坏酶及改善物料结构和特性的作用[19]。黄训端等[20]发现蜡样芽孢杆菌(1010CFU/mL)在室温下施压15 min，压力越大对芽孢杆菌的损伤程度越大，死亡率越高。脉冲电场杀菌技术是将高电压(15～100 kV/cm)脉冲作用于电极间的食品，常温下进行，作用时间极短，一般<1 s。高压杀菌技术对于一些对压力抵抗力较弱的芽孢杆菌极富效果，对某些顽强的芽孢需要更大压力。超高压设备体积大而昂贵，小型生产企业难以应用，导致超高压杀菌法无法广泛应用。

1.3 气体杀菌法

气体杀菌法主要包括臭氧杀菌法和二氧化氯杀菌法等。臭氧具有广谱抗菌特性，对细菌营养细胞、芽孢、病毒、真菌均有高效杀灭作用。2001年FDA将臭氧列入可直接与食品接触的添加剂范围[21]。耿淑洁等[22]发现臭氧对枯草芽孢杆菌芽孢有较强的灭活作用。在pH为8.16、水温为(20±1)℃条件下，7个对数级芽孢经臭氧作用5 min后，失活4.68个对数级，可控制绝大多数芽孢杆菌的活性，但对于生长繁殖极其迅速的芽孢杆菌来说，杀灭不彻底就意味着芽孢杆菌仍对食品存在巨大威胁。2013年白小龙[23]发现在二氧化氯气体质量浓度为100 mg/L、杀菌40 min，二氧化氯气体对苦荞表面的枯草芽孢杆菌具有良好杀灭效果。但气体杀菌法对于结构致密的物质而言，难以达到其内部，仅能杀灭物质表面的芽孢杆菌，不能对内部芽孢杆菌进行良好的抑制。

1.4 化学灭菌法

化学灭菌法包括添加抑菌剂和添加消毒剂。常用的抑菌剂包括山梨酸钾、苯甲酸钠、表没食子儿茶素没食子酸酯、乳酸钠、乳酸链球菌素等。AOUADHI等发现山梨酸钾和乳酸链球菌素联合作用，在24 h内可以缓慢抑制LTIS27型芽孢杆菌的萌发和生长，在5 d后可以达到完全抑制的作用。现阶段人们更加趋向于对天然抑菌剂的研究,如丁香酚[24]、肉桂醛[25]、大蒜素[26]和鱼腥草[27]等物质，虽然这些物质可以对芽孢杆菌起到一定抑制作用，但不能完全抑制或者及时杀灭。还有其他化学物质如乙醇、乙酸等，这些物质的添加会导致食品色泽风味的改变，令消费者难以接受，且作用效果不显著。现今对于食品安全的重视导致化学物质的加入,增加了消费者购买的心理顾虑，越来越多的人拒绝添加剂的滥用。

1.5 促萌发法

由于芽孢杆菌的特殊生理结构，常规有害微生物的防治方法并不适用于芽孢杆菌的灭活，技术上存在一定的壁垒，消费者心理也难以承受。近年来对于促萌发法的研究引起了人们的广泛关注，其优点在于添加的物质成分简单易于接受，作用较为迅速。孢子的萌发是芽孢杆菌生长繁殖的第一步，此时萌发形成的营养细胞对于外界环境失去抗性，简单方法即可完全杀灭。

这种方法主要分为两种方式，一种采用营养物质如葡萄糖、果糖、L-丙氨酸和D-丙氨酸等，另一种是用非营养物质如Ca+-DPA和十二烷烃等诱导内生芽孢萌发，产生营养细胞用较低温度(65 ℃, 30 min)即可将芽孢杆菌杀灭的方法。TEHRI等[28]用糖类和氨基酸对巨大芽孢杆菌MTCC2949诱导萌发，用吸光度、荧光染色和酯酶测定萌发效果，发现L-丙氨酸可以有效诱导芽孢杆菌孢子萌发。AOUADHI等[29]在2013年将D-葡萄糖(1 mmol/L)和L-丙氨酸(100 mmol/L)混合使得LTIS27芽孢杆菌萌发89%。通过对于不同种类以及不同基因型芽孢杆菌的研究发现：不同芽孢杆菌需要不同的促萌发剂，筛选出一种广谱高效的促萌发剂至关重要。不同促萌发剂的混合使用可以增加芽孢杆菌的萌发率，目前对于营养物质混合添加是增加促萌发率行之有效的办法之一。

2 芽孢杆菌的杀菌机理研究进展

2.1 核蛋白以及酶对芽孢杆菌的影响

常规热杀菌的杀菌机理就是通过热传递与热传导将热能转移到芽孢内层核心部位，使芽孢质和芽孢核中的酶等蛋白变质，蛋白质的变质会导致细胞无法增殖分化，从基因层面以及生长环境方面抑制芽孢杆菌的活性，达到灭活的目的。

高压杀菌法的杀菌机理是使芽孢杆菌中的氢键、离子键和疏水键等非共价键发生改变，破坏蛋白质和酶的稳定性，从而杀灭芽孢杆菌。HO等[30]用高压脉冲电场(HPEF)处理水溶液中几种酶，发现HPEF对葡萄糖氧化酶，脂肪酶，α-淀粉酶钝化率都达到了75%以上，而α-淀粉酶钝化率更是达到了85%。过氧化物酶钝化率30%，多酚氧化酶钝化率40%，碱性磷酸酶的钝化率只有5%。可以发现高压也是作用于细胞的酶，达到杀菌的作用。100～200 MPa下可以使芽孢杆菌的受体蛋白被激活，而更高压力(500～600 MPa)下可以导致Ca2+-DPA通道打开，引起孢子的萌发。

臭氧杀菌作用机理是先作用于细胞膜，使膜构成成分受损伤而导致新陈代谢障碍，臭氧继续渗透穿过膜而破坏膜内脂蛋白和脂多糖，改变细胞的通透性，导致细胞溶解、死亡；同时臭氧还能使细胞活动所必要的酶失去活性，而影响其正常的生理功能。臭氧作用方式有两种：I.臭氧溶于水直接反应；II.臭氧分解生成的羟基间接反应。一般情况下由两种方式同时发挥作用，作用效果更强[31]。CO2与高压同时作用使芽孢杆菌机械性损伤，导致细胞核内容物外泄，严重破坏其生理结构[32]。

霍健聪等[33]将鱼腥草提取物作用于枯草芽孢杆菌的细胞壁，造成细胞壁破裂，内容物泄漏，最终导致菌体崩解、死亡。与丁香酚、柠檬醛等作用机制相似，都是作用于芽孢杆菌细胞壁，最终发挥抑菌效果。王晓英[34]发现蒲公英总黄酮类提取物可以妨碍芽孢杆菌蛋白质的正常表达，导致芽孢杆菌正常生理功能丧失，起到抑菌作用。王涛[35]在2011年发现嗜热脂肪芽孢杆菌通过抑制剂的作用可导致细胞耐热性明显降低，进而破坏细胞结构，引起细胞凋亡。

2.2 膜受体以及通道对于芽孢杆菌的影响

促萌发方法的杀菌机理：营养物质诱导的萌发是由于芽孢杆菌表面的营养受体引起的，研究表明只有外界化学物质与其特定的受体蛋白结合，才能传导萌发信号。现发现营养受体上有3种操纵子gerA、gerB和gerK，gerA操纵子是芽孢杆菌孢子萌发的主要操纵子[36-37]，gerA上含有gerAA、gerAB和gerAC三种同源编码蛋白[38]。萌发的孢子中至少含有其中一种操纵子才能行使萌发功能。萌发剂与受体之间并不是一一对应的关系，有时一种促萌剂需要多种受体同时发挥作用，如gerA是L-丙氨酸的受体蛋白[39]，gerB和gerK是葡萄糖的萌发受体[40]。营养物质对不同基因型的芽孢杆菌是否起萌发作用也要归因于萌发受体的识别作用。这些操纵子向核蛋白传递信号，启动萌发程序，在十几分钟甚至几分钟就可以完成萌发指令。另外有研究表明营养物质进入芽孢杆菌的内部过程需要经过孢子衣与皮层，而芽孢杆菌中的另一种蛋白gerP是参与编码芽孢杆菌外壁的主要蛋白，对芽孢杆菌的杀灭同样起重要作用[41]。

非营养物质诱导的萌发可能是由于离子通道受阻引起的，其中离子通道主要包括：钾离子通道、钙离子通道、钠离子通道等。不同物质抑制芽孢杆菌孢子萌发的离子通道是不同的[42]。芽孢杆菌萌发会导致细胞透过性增强，导致细胞核中的氢离子、钾离子和钠离子外泄，同时伴随着钙离子的释放。JOHNSON[43]发现枯草芽孢杆菌中YlaJ和YhcN蛋白的缺失会降低孢子的萌发速率，可能是YlaJ和YhcN蛋白参与编码SleB和cwlJ皮质水解酶，其中SleB皮质水解酶发挥主要作用。皮质水解酶会分解芽孢壁，导致芽孢萌发速率的改变。在蜡样芽孢杆菌中发现一种受体蛋白gerN，与次黄嘌呤核苷酸诱导的萌发密切相关[44]。次黄嘌呤核苷酸对于离子变化极其敏感，因此推断gerN可能参与编码细胞内的离子通道。

两种杀菌机理相辅相成，细胞膜的皮质水解酶中的肽聚糖受损，易导致外来物质(营养物质以及非营养物质)的进入，同时也导致细胞核内的阳离子外流，增加了细胞膜的流动性，影响离子通道的开放。微观层面上是由于细胞膜表面上的蛋白受体，受操纵子的影响反作用于细胞核刺激释放出萌发信号。同时细胞中的胞内酶与胞外酶受蛋白质的影响，溶解芽孢杆菌外层坚韧结构，使芽孢杆菌对外界环境抗性降低，最终引起细胞的灭活。

3 结论与展望

随着人民生活水平的提高，消费者对于食品安全格外看重。芽孢杆菌不易被完全杀灭，在食品中萌发会降低食品保质期，危害消费者健康。因此对芽孢杆菌杀灭技术的研究是不可或缺的，有效地保证食品安全，提高人民对于芽孢杆菌的重视至关重要。目前对于芽孢杆菌的杀灭仍存在如下问题：(1)芽孢的多层结构在整个生长周期中，分别起到何种作用以及作用机理尚不明确。(2)目前对于芽孢杆菌的研究逐年增多，但仅限于对单种芽孢杆菌的杀灭研究，实际生产中常出现两种甚至多种芽孢杆菌同时存在的情况，多种芽孢杆菌间的协同或拮抗作用对于芽孢杆菌杀灭的影响尚未明确。(3)添加有益菌防治有害菌仍是目前许多致病菌的有效防治手段，但筛选对芽孢杆菌有杀灭作用的益生菌的研究寥寥无几，对于其中有效成分的提取及分析更是未见涉及。(4)近几年，一些芽孢杆菌开始作为益生素加入到食品和饲料中，作为有益微生物促进植物生长、防治病虫害。但对于这些菌株的安全性评价尚未作出明确的认定。

芽孢杆菌的防控已经越来越受广大研究者的重视，目前研究主要针对芽孢杆菌的杀灭方法，对于芽孢杆菌的杀灭机理的研究仍然缺乏，应该加大这方面的研究力度。探索不同基因型芽孢杆菌之间的共性，可为有效杀灭芽孢杆菌提供理论依据。同时，应考虑消费者对添加物的接受度，对其安全性和有效性进行系统的研究。还可以将抑菌剂与萌发剂进行整合，开发复合防控手段，为食品生产企业提供高效的技术支撑。