莫大超，李君久，彭 亮，刘志远，王杰云，袁积汝

(广东省东莞东华医院 普外科，广东 东莞 523110)

胆结石是一类由于人类胆囊内形成的结石所引起的疾病，该疾病较为常见其患病率在美国大约为15%，而在欧洲则为4%～21%[1]。有研究表明大约1/4的60岁以上女性患有胆结石[2]。相较于西方国家我国的胆结石患病率较低，为5%左右[3]。大多数的胆结石患者并未表现出任何症状，而有10%～20%的患者会表现出腹部剧烈疼痛、恶心、呕吐、甚至黄疸和高热等症状[2]。

既往的流行病学研究已经确定出了包括年龄、性别、营养素摄取[4-5]、糖尿病[6]等在内的大量胆结石危险因素，而胆结石家族史对于胆结石的发病也存在着显著性的影响[7]。既往基于双生子的研究提示胆结石是一类环境与遗传共同作用的复杂疾病，遗传因素可以解释25%的胆结石疾病表型差异[8]。针对胆结石，既往的遗传学关联研究已经确定了包括ABCG8，UGT1A1，GCKR等基因在内的大量易感基因[9-11]。近期一项基于非洲和西班牙裔美国人的全基因组关联研究提示TM4SF4基因的rs9843304位点与胆结石的疾病状态之间的关联具有统计学意义[12]。然而由于复杂疾病遗传背景差异的影响，该研究结果尚未在中国人群中得到有效验证。本研究中我们基于中国广东汉族群体的580名胆结石患者和1 140名健康对照，调查覆盖整个TM4SF4基因区域的12个单核苷酸多态性位点(SNP)基因型在胆结石病例和健康对照组中的分布情况，从而对其遗传学关联性进行分析。

1 对象与方法

1.1 对象 研究对象包含在东莞东华医院行胆囊切除术的580名胆结石患者(女性242例，男性338例)，以及1 140名经B超检查证实无胆结石的健康受试者(作为对照)。为了确保病例组和对照组的年龄尽可能的相匹配，我们所收集的样本年龄差距控制在±3岁之内。此外，为了避免出现可能的群体分层现象，本研究所包括的所有样本均为来自于东莞及周边地区出生和居住的中国汉族人群，且三代之内没有迁徙史。我们对胆结石的胆固醇含量进行测量并分类，将胆固醇含量大于50%的胆结石归类为胆固醇胆结石。本研究所纳入的患者均为胆固醇胆结石。所有对照样本均为在本医院接受体检且通过B超检查证实无胆结石的个体，或因胆囊息肉或胆囊腺瘤而进行胆囊切除术并被证实无胆结石的个体。所有受试者取5 mL静脉血用于提取DNA。本研究经东莞东华医院的伦理委员会批准，并获得每位患者的书面知情同意。

1.2 SNP位点选择与基因分型 利用千人基因组数据库中的北京汉族人群数据，选取TM4SF4基因内最小等位基因频率(minor allele frequency,MAF)≥0.05且杂合度≥0.2的SNPs位点，共计136个。随后基于这些SNPs以r2≥0.7为条件进行标签SNP的遴选。最终，总共12个标签SNPs(rs9843304，rs73152651，rs9793，rs13062142，rs4681510，rs9880538，rs34447987，rs529680502，rs10460856，rs6440616，rs72615627，rs79586514)纳入本研究的后续分析。依据DNA提取试剂盒说明书(Genomic DNA kit，Axygen Scientific Inc，CA，USA)的步骤提取外周血细胞中的基因组DNA，-80℃保存备用。委托上海邃志生物科技股份有限公司使用高通量SequenomMassARRAY平台(Sequenom，San Diego，CA，USA)对标签SNP进行基因分型，并采用SequenomTyper 4.0软件处理结果。整个基因分型过程中隐藏了样品的病例/对照状态。本研究中每个标签SNP以及整体基因分型成功率均大于99%。

1.3 统计分析 我们首先对所选12个SNP位点的基因型频率和哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium,HWE)情况进行了分析，随后通过Haploview等[13]对12个所选SNP的连锁不平衡结构进行了展示。最后我们采用χ2检验对12个所选SNP与胆结石疾病状态的遗传学关联性进行了检验。此外我们利用线性回归模型对具有统计学意义的SNP与四项血脂指标的关联性进行了分析。年龄、性别以及BMI作为协变量加入模型进行校正。主要的遗传学关联分析由遗传学分析软件Plink等[14]完成。本研究中我们采用Bonferroni校正对多重检验问题进行处理，单位点关联分析的P值阈值为0.05/12≈0.004。

2 结果

2.1 人口学特征分析 本次研究对象的人口学特征信息如表1所示。本次研究中共纳入胆结石患者580名，健康对照1 140名。其中性别、年龄、BMI、血清总胆固醇、甘油三酯以及高密度脂蛋白水平在胆结石病例和健康对照患者中的差异不具有统计学意义，只有低密度脂蛋白水平的名义P值小于0.05。

表1 本次研究纳入样本基本信息

2.2 遗传学关联分析 本课题共选取覆盖TM4SF4基因的12个单核苷酸多态性位点(SNP)，我们在前期对这些SNP的MAF进行计算并对其H-W平衡情况进行检验，结果如表2所示。其中我们可以看出全部12个SNP的MAF均大于0.05，而且均处于H-W平衡状态。

表2 本次研究所选12个SNP的基本信息

*：MAF:次等位基因频率；**：HWE：哈迪温博格平衡检验P值。

本次研究所选择的12个SNP位点的连锁不平衡图谱如图1所示，由于本次研究选择的为标签SNP，因此不同SNP间的连锁不平衡并不显著，独立性较好。表3展示了针对TM4SF4基因的12个SNP的遗传学关联分析结果。经过多重检验校正，只有rs9843304位点与胆结石的疾病状态的关联存在统计学意义(OR=1.27，P=0.0008)。rs9843304位点的C等位基因可以显著性的提高胆结石在人群中的发病危险度，该等位基因在胆结石病例组中的等位基因频率为0.53，而在对照组中这一数值为0.47。此后针对rs9843304位点与4种血脂指标的遗传学关联分析结果发现包括血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白以及高密度脂蛋白在内的四种血脂指标与rs9843304位点基因型的关联不具有统计学意义(见表4)。

图1 12个SNP位点的连锁不平衡图谱

表3 针对TM4SF4基因的12个SNP的遗传学关联分析结果

(表注)显著性结果加粗显示。

表4 显著性位点rs9843304与四种生化指标的遗传学关联分析结果

3 讨论

TM4SF4基因编码的蛋白为四跨膜蛋白家族的一种。这类蛋白通过信号转导参与了细胞的发育、激活、生长和运动的调节[15]，而TM4SF4蛋白则作为一种细胞表面糖蛋白参与了细胞增殖的调节[15]。既往研究表明TM4SF4基因编码的蛋白在肝脏的再生和胰腺发育中起到了重要的作用[16]，既往针对该基因的RNA测序分析显示该基因在人类胆囊组织中表达量较高，尤其是在慢性胆囊炎及胆结石患者中表达量更高[12]。这些结果提示TM4SF4基因在胆结石的发病和发展过程中可能存在着一定作用，但其具体机制尚未明晰。通过检索GTEx数据库发现SNP rs9843304在人类睾丸、甲状腺以及胰腺组织中均可以显著性的影响TM4SF4基因的表达[17]。该位点的C等位基因在睾丸和甲状腺组织中与TM4SF4基因的高表达相关，而在胰腺组织中则作用相反。这一结果提示SNP rs9843304可能是通过对TM4SF4基因表达的影响进而作用于胆结石的发病过程的。但是由于GTEx数据库并未记录胆结石疾病靶组织数据，因此未来还需要生物实验来对SNP位点rs9843304的作用进行验证。

本次研究针对覆盖TM4SF4基因区域的12个SNP与胆结石的遗传学关联性进行了考察。研究结果表明rs9843304位点与胆结石的疾病状态之间的关联具有统计学意义，这一结果与较早前基于非洲裔和西班牙裔美国人的全基因组关联研究结果基本一致。rs9843304位点位于TM4SF4基因内含子区域，因此其并不具有改变TM4SF4基因编码蛋白结构的生物学功能。本次研究所发现的关联信号有可能是通过与潜在的易感位点存在连锁不平衡而产生的，也可能是由于其对TM4SF4基因的表达有一定调控作用。如果是前者那么基于基因测序技术的研究设计可以帮助我们明晰这些潜在的易感位点，而如果是后者那么未来针对该位点的生物学功能研究则有待展开。此外，由于本研究并未采集进行分层分析的相关数据，由于信息不足可能使得本研究结果的应用价值受到一定限制。

本次研究还针对rs9843304位点与4种血脂指标的遗传学关联进行了分析，分析结果显示这4种血脂指标与rs9843304位点基因型之间的关联不具有统计学意义。这一结果提示rs9843304位点与胆结石疾病状态的遗传学关联可能并未通过血脂指标进行中介，其对于胆结石疾病的影响可能是独立的遗传学作用。当然，由于样本量的限制，这些阴性结果也可能是由于有限的统计学效能所致，未来结合更大规模样本的验证性研究亟待展开。

本次研究基于来自于中国广东地区汉族人群的580名胆结石患者和1 140名健康对照，选取了覆盖TM4SF4基因的12个SNP位点并考察了这些位点与胆结石疾病状态的关联性。我们的研究在中国群体中验证了TM4SF4基因rs9843304位点与胆结石的关联具有统计学意义，从群体遗传学的角度为TM4SF4基因与胆结石疾病机制的联系提供了证据。