杨 雨，陈 琦

(1.遵义医科大学 研究生院，贵州 遵义 563099； 2.遵义医科大学附属医院 血液内科，贵州 遵义 563099)

Burkitt淋巴瘤(Burkitt lymphoma，BL)是最具侵袭性的非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma,NHL)亚型之一，患者多以盗汗、乏力、皮肤瘙痒、体重下降为主要临床表现[1]。现治疗上以环磷酰胺、长春新碱、阿霉素和地塞米松(hyper-CVAD方案 )化疗为主，大多数患者预后良好。然而，包括肿瘤溶解、感染和中枢神经系统复发在内的并发症以及化疗毒副作用严重影响患者的治疗效果，因此研究BL的其它治疗方法具有重要意义[2-4]。可溶性CD40配体(soluble CD40 ligand，sCD40L)属于肿瘤坏死因子超家族成员，其与CD40的配体-受体藕联在机体的体液免疫及细胞免疫中起重要作用，被认为是一种具有治疗癌症潜力的共刺激分子[5]。本课题组前期研究发现sCD40L对人B细胞淋巴瘤BJAB细胞的增殖有抑制，诱导其凋亡，其机制可能与上调Bax、Caspase-9，及下调BCL-2蛋白的表达以及干扰细胞周期有关[6]，提示sCD40L可通过刺激死亡受体途径和线粒体途径，改变细胞周期细胞分布来促进B淋巴瘤细胞凋亡和抑制细胞的增殖。本文通过检测sCD40L对人Burkitt淋巴瘤细胞系Raji细胞株增殖、凋亡、细胞周期以及MAPK通路相关因子ras、raf、MEK、ERK1/2 在mRNA及蛋白水平表达的影响，进一步探讨sCD40L对B细胞淋巴瘤的其它类型或细胞系的可能作用机制，并为其能否运用于BL的治疗而提供更多的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人Burkitt's淋巴瘤Raji细胞购自中国科学院上海生命研究院细胞资源中心；RPMI1640培养基和胎牛血清购自GIBCO公司；sCD40L购自以色列ProSpec公司；CCK-8试剂盒和Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒分别购自Dojindo公司和上海七海富泰生物科技有限公司；RT-PCR的试剂购自Takara 公司，引物由生工生物工程股份有限公司购买。一抗(小鼠抗人)ras、ERK1/2购自武汉三鹰生物技术有限公司，raf、MEK、GAPDH购自Abcam公司；二抗(羊抗兔)由Cell Signaling Technology公司购买。

1.2 方法

1.2.1 Raji细胞培养 Raji细胞为悬浮细胞，以90%RPMI1640及10%胎牛血清配置的完全培养基，置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养，每隔1～2天换液，2～3 d传代。取生长状态良好，聚团数多而均匀且呈对数期生长的细胞开展后续试验。

1.2.2 CCK-8法检测sCD40L 对Raji细胞增殖的影响 取处于对数生长状态，聚团情况良好的Raji细胞细胞，分为实验组、对照组及空白调零组，将细胞离心重悬并以细胞数为1×104个/孔接种96孔板，每孔 50 μL，每组6个复孔。实验组加入sCD40L母液50 μL，使终浓度分别为0.25、0.5、1、2、4 μg/mL；对照组和空白调零组分别添加完全培养基，使终体积为100μL/孔。分别培养 24、48、72 h后，快速向各孔加入10 μL CCK-8试剂，避光混匀，培养箱中培养3h，用酶标仪测定在450 nm处的OD值；并计算Raji细胞生存率：生存率=[(OD 对照组-OD 实验组)/(OD 对照组-OD 空白组)]×100%。

1.2.3 Annexin/PI 双染法检测Raji细胞凋亡 取对数生长期Raji细胞以3×105个/孔，铺于6孔板，分为实验组和对照组，每组3个复孔。在37℃，5% CO2培养箱中培养24 h后，实验组加入浓度为4 μg/mL的sCD40L，对照组加入相同体积的培养基，分别培养24、48、72 h。离心收集并用PBS清洗细胞，Annevix Binding Buffer稀释后取100μL重悬；加入5μL Annevix FITC，室温避光孵育15 min，再加入5μL PI，室温避光孵育10 min，补加150 μL Annevix Binding Buffer后上机进行细胞凋亡检测和分析。

1.2.4 流式细胞仪检测Raji细胞周期 取对数生长期Raji细胞以3×105个/孔，铺于6孔板，每组3个复孔。培养箱中培养24 h后，实验组加入浓度为4 μg/mL的sCD40L，对照组补充同体积的完全培养基。培养24、48、72 h分别后收集细胞，PBS清洗重悬细胞，再逐滴加入到-20℃预冷的乙醇中，4℃固定过夜；PBS清洗，去除乙醇，加入200～300 μL PI/RNase染液，室温避光孵育15 min，上机进行细胞周期检测。

1.2.5 荧光定量PCR检测ras、raf、MEK、ERK1/2的mRNA水平表达 取浓度为 1×106个/mL的Raji 细胞悬液 0.5mL 接种于24 孔板中，设置sCD40L浓度为4 μg/mL的实验组及不加sCD40L的对照组，分别培养24、48、72 h后收集细胞，提取RNA，通过OD260/OD280比值测定RNA纯度和含量。按照如表1所示体系，于37℃ 15 min逆转录成cDNA，85℃ 5 s灭活逆转录酶。

表1 逆转录体系

逆转录完毕后，按Takala试剂盒说明进行实时荧光定量PCR检测，其扩增体系总反应体积为20 μL，包括cDNA 1 μL；SYBR®Premix Ex TaqTM10 μL；上下游引物2 μL；DEPC水7 μL。各基因引物序列及扩增片段长度见表2。PCR预变性95 ℃ 30 s，1 cycle，扩增反应为95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，40 cycle。计算2^-ΔΔCt以判断各基因表达量的变化。

表2 各基因引物序列及扩增片段长度

1.2.6 Western blot测定ras、raf、MEK、ERK1/2蛋白水平的变化 收集浓度为4 μg/mL的sCD40L处理24、48、72 h后的细胞，用PBS清洗2次后，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，离心收集上清以BCA法测定蛋白浓度。配置SDS聚丙烯酰胺分离胶和浓缩胶，分别灌制玻璃板，装置电泳槽，加入电泳缓冲液，点加样本和预染Marker，通电进行电泳。制作转膜装置通电1.5 h将凝胶上的蛋白转至聚偏氟乙烯(Polyvinylidene fluoride membrane,PVDF)膜上，脱脂奶粉室温封闭1h后分别与一抗和二抗孵育。一抗为鼠抗人单克隆抗体，分别为ras (1∶1 000)、raf (1∶1 000)、MEK (1∶1 000)、ERK1/2 (1∶1 000)、GAPDH (1∶3 000)；二抗稀释比例为1∶5 000。与抗体结合后的PVDF膜洗涤后经ECL试剂盒显色并曝光，以GAPDH为内参，用Image J通过灰度值分析检测各蛋白的表达情况。

2 结果

2.1 CCK-8检测sCD40L对Raji细胞体外增殖的影响 不同浓度sCD40L对人Burkitt淋巴瘤Raji细胞作用24、48、72 h后对其生存率均有抑制作用；随着浓度和时间的增大，sCD40L对Raji细胞生存率的影响越大。如表3所示，sCD40L 和Raji细胞作用24 h后，浓度为4 μg/mL与对照组相比具有统计学意义(P<0.05)，余下各浓度组与对照组比较无统计学差异(P>0.05)。sCD40L 和Raji细胞作用48 h，浓度为1、2、4 μg/mL与对照组比较具有统计学意义(P<0.05)；sCD40L 和Raji细胞作用72 h，所有浓度组与对照组比较均具有统计学意义(P<0.05)。而同一浓度不同时间下，浓度为1、2、4 μg/mL的作用Raji细胞48 h后与24 h相比具有统计学意义，P<0.05。浓度为0.5、1、2、4 μg/mL的作用72 h后与24、48 h相比均有统计学意义，P<0.05。提示sCD40L对Raji细胞生存率的影响具有剂量-时间效应关系。其中以sCD40L的最大浓度为4 μg/mL对Raji细胞抑制作用最明显，以72 h抑制作用最明显，与其它时间相比具有统计学意义(P<0.05)。

表3 不同时间和浓度sCD40L对Raji细胞生存率的影响

*：与对照组比较，P<0.05；△：与24 h比较，P<0.05；▲：与48 h，P<0.05。

2.2 Annexin/PI 双染法检测Raji细胞凋亡 以浓度为4 μg/mL为干预浓度的sCD40L 作用24、48、72 h后，Raji细胞的凋亡率见表4所示，分别与对照组相同时间比较具有统计学意义(P<0.05)。结果提示随着sCD40L 作用时间延长，Raji细胞凋亡率逐渐增高。

表4 不同时间4 μg/mL sCD40L对Raji细胞凋亡率的影响

*：与对照组比较，P<0.05；△：与24 h比较，P<0.05；▲：与48 h，P<0.05。

A、B、C分别为sCD40L干预 Raji细胞24 h、48 h、72 h后凋亡情况图1 不同时间sCD40L对Raji细胞凋亡率的影响

2.3 流式细胞仪检测sCD40L对细胞周期的影响 浓度为4 μg/mL的sCD40L与Raji细胞共育24、48、72 h后，细胞在G0/G1期所占比例分别与对照组同时间比较具有统计学意义(P<0.05)，S期及G2/M期细胞所占比例较对照组有所降低；实验组各周期之间对比有差异(P<0.05)。结果(见表5)提示sCD40L可能阻滞Raji细胞在G0/G1期。

表5 不同时间sCD40L对Raji细胞的细胞周期分布影响

*：与对照组比较，P<0.05。

2.4 Real-time PCR检测sCD40L对ras、raf、MEK、ERK1/2mRNA的影响 以浓度为4 μg/mL的sCD40L与Raji细胞分别共育24、48、72 h后，ras mRNA、raf mRNA、MEK mRNA、ERK1/2 mRNA表达量变化提示随着时间的延长，各基因表达量呈降低趋势。以上各基因表达量与同时间细胞对照组比较均有差异(P<0.05)，结果(见表6)。

表6 不同时间4 μg/mL sCD40L对Raji细胞ras、raf、MEK、ERK1/2 mRNA表达的影响

*：与对照组比较，P<0.05。

2.5 Western blot测定ras、raf、MEK、ERK1/2蛋白水平的变化 以浓度为4 μg/mL的sCD40L作用Raji细胞24、48、72 h后，ras、raf、MEK、ERK1/2蛋白表达量变化结果提示，随着时间的延长，ras、raf、MEK、ERK1/2蛋白表达量呈降低趋势(见图2)，raf蛋白24 h实验组表达量与同时间对照组比较无统计学差异(P>0.05)，其余时间及其他蛋白实验组与对照组比较具有统计学意义(P<0.05)。结果(见表7、图2)。

表7 不同时间4 μg/mL sCD40L对Raji细胞ras、raf、MEK、ERK1/2 蛋白表达的影响

*：与对照组比较，P<0.05。

*：浓度为4 μg/mL的实验组与空白细胞对照组组间比较，P<0.05；n=3。图2 4 μg/mL的sCD40L对Raji细胞中ras、raf、MEK、ERK1/2蛋白表达的影响

3 讨论

BL是起源于生发中心B细胞的一种具有高度侵袭性的淋巴瘤，组织学上以中等大小的弥漫性单形多核仁B细胞的高增殖和频繁的有丝分裂为表现[7]，其B细胞异常克隆扩增常导致自发性肿瘤溶解，因而患者常伴有乳酸脱氢酶(LDH)升高[8]。大多数BL患者通过强化化疗治愈，然而，老年患者和复发患者的预后较差，因而进一步促使我们探索更多新的方案来治疗BL。

CD40是肿瘤坏死因子受体(TNFR)成员，在B细胞表面表达，常以膜结合性CD40L(mCD40L)与T细胞相互作用并辅助免疫应答反应，发挥抗原递呈方面的作用[9]。有研究发现CD40在抗体亲和力成熟、生发中心形成和记忆B细胞的发育方面存在缺陷[10]，提示机体的肿瘤免疫应答异常或低下可能与CD40信号通路低表达或受抑制有关，且CD40的信号作用可能影响B细胞淋巴瘤的转归，因此CD40L可能与CD40受体的藕联，通过参与调节相关信号通路因子的平衡而达到调控肿瘤，特别是B细胞淋巴瘤的发展[11]。本实验中随着sCD40L浓度增加，对Raji细胞生存率的抑制也逐渐增高，提示sCD40L作用于Raji细胞后其抑制作用呈剂量-效应关系。以浓度为4 μg/mL为干预浓度的sCD40L 作用24、48、72h，Raji细胞的凋亡率逐渐增高，72 h凋亡率最高，提示 sCD40L 浓度为4 μg/mL 时，可诱导Raji细胞的凋亡，随着sCD40L 作用时间延长，Raji细胞凋亡率逐渐增高。

在信号通路相关基因变化与细胞凋亡的研究中，除外膜上的死亡受体途径和胞质内的线粒体途径，这两条经典途径的上游及传导过程中还受到MAPK信号通路的调控[12]。国外在高血压与周围血小板活化相关关联机制的研究中发现CD40L能诱导神经胶质(星形胶质细胞和小胶质细胞)的激活，并刺激NF-кB和MAPK相关炎症因子的增加，最后使正常细胞炎性死亡而造成神经炎症和神经损伤[13]。Wang等发现CD40L能够在翻译前水平上调Graves眼病患者眼眶成纤维细胞中VCAM-1和e-选择素的表达[14]。上述实验研究表明CD40L与MAPK通路有关联，前者在诱导NF-κB，激活PI3K以及MAPK通路引发的相关炎症反应中起到重要作用。

MAPK通路包含不同的信号级联，其中ras/raf/MEK/ERK1/2(细胞外信号调节激酶1和2)是人类肿瘤中最常失调的信号级联之一[15]，该级联的各通路因子也是诱发性肿瘤形成和发展的主要中介物。有研究表明SDC-1可通过阻断人结肠直肠癌细胞中的JAK1 / STAT3和ras / raf / MEK / ERK途径来抑制细胞生长，迁移[16]。组蛋白乙酰转移酶CREBBP突变可能有助于增强急性淋巴细胞白血病中的致癌RAS信号传导[17]。Crassini等发现包括由B细胞，Toll样和趋化因子受体介导的信号通路会聚于raf-1 / MEK / ERK1 / 2-MAPK途径，从而调控慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukaemia,CLL)细胞的存活和增殖。而MEK1 / 2抑制剂比美替你(Binimetinib)可通过下调Mcl-1活性显着提高与表达CD40L的成纤维细胞共培养的CLL细胞对BH3模拟物的敏感性和对Bim(BCL2L11)和Bcl-xL(BCL2L1)表达，从而对CLL细胞产生细胞毒性和细胞抑制作用[18]。另有研究表明，实验肽EP2014 / 064243可通过干预Ras与Raf相互作用结合位点增强环磷酰胺的抗肿瘤作用，及其在小鼠侵袭性淋巴瘤中的促凋亡特性[19]。阿帕替尼(Apatinib)在体外和体内均对各种类型的NHL细胞(包括BL，套细胞淋巴瘤和弥漫大B细胞淋巴瘤GCB或ABC型)显示出显著的细胞毒活性，其抗NHL活性可能与靶向VEGFR2及其下游的ras / raf / MEK / ERK途径从而抑制肿瘤细胞生长，诱导凋亡以及抗血管生成有关[20]。上述相关研究提示ras/raf/MEK/ERK是调节癌细胞增殖和凋亡的重要途径，而干预MAPK通路相关因子可能是靶向治疗血液系统肿瘤特别是淋巴瘤的关键之一。

结合本课题组前期对sCD40L在恶性血液肿瘤的研究，以及在炎症反应中，CD40L对MAPK通路有影响和调控的作用，再联系抑制MAPK通路相关因子作为治疗肿瘤靶点的作用机制，提示利用sCD40L可能会直接通过抑制MAPK通路改变细胞周期分布并达到抑制增殖和促进凋亡的抗肿瘤作用。本实验中sCD40L处理Raji细胞24、48、72h后，raf、ras、MEK、ERK1/2 mRNA的表达量呈降低趋势且与对照组相比较均有差异(P<0.05)，说明sCD40L在体外对Raji细胞增殖抑制及促进其凋亡的机制可能与ras、raf、MEK、ERK1/2 mRNA及蛋白表达的下调有关，提示与该级联为代表的MAPK通路失活相关。

MAPK通路相关信号因子能与细胞周期进行关联，通过作用细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)及其调节抑制剂等关键蛋白以调节细胞周期的分布。p21作为CDK抑制剂除抑制G1 CDK细胞周期蛋白复合物，还具有通过结合并抑制增殖细胞核抗原来抑制DNA合成的能力[21]。p21蛋白的表达受RAS相关因子5(NORE1A / RASSF5)调节，在肿瘤发展中NORE1A表达经常被启动子甲基化下调[22]。在结构上，NORE1A含有RAS结合结构域可以GTP依赖性方式直接结合RAS癌蛋白，导致细胞周期S期细胞数量减少，促进RAS依赖性和非依赖性的细胞凋亡[23]。在本实验用浓度为4 μg/mL的sCD40L处理24、48、72 h后，Raji细胞G0/G1期的细胞比例增加，S、G2/M细胞比例降低，与对照组相比有差异(P<0.05)，细胞被阻滞在G0/G1期，结合本实验中ras mRNA及蛋白的表达量随时间增加呈逐渐降低趋势，提示可能与NORE1A蛋白表达上调抑制RAS因子的活化有关。

综上所述，sCD40L在体外可抑制Raji细胞增殖并促进其凋亡，并将Raji细胞阻滞在G0/G1期，其机制可能与抑制MAPK通路相关因子ras、raf、MEK、ERK1/2 mRNA及蛋白的表达有关。本实验为体外培养Raji细胞，在样本量及时间和浓度的设定存在不足，以后将增加相关通路蛋白和激活或抑制剂从蛋白水平验证sCD40L对MAPK相关通路因子的抑制机制，并引入动物实验，进一步探索sCD40L在体内抗Burkitt淋巴瘤的效果。