胡斌丽，丁宏伟，李 达

(遵义医科大学 公共卫生学院，贵州 遵义 563099)

镉是一种常见的重金属毒物，生物蓄积性强，半衰期长，毒性持久。大量文献报道，镉对机体多组织器官系统产生毒性作用[1-3]。睾丸是镉的主要靶器官之一，与肝脏等其它器官相比，镉更易导致睾丸损伤，有实验证实对镉有解毒作用的金属硫蛋白(metallothionein，MT)的基因在睾丸内不能被诱导表达或合成量不足[4]。镉在雄性生殖系统方面的研究已成为国内外研究的热点，动物实验研究多限于亲代，而对子代的影响鲜有报告，尤其是睾丸作为靶器官，在性成熟后生精功能是否发生改变、进而影响其生殖能力。为此，本实验通过对大鼠孕期、哺乳期染镉，分析其雄性仔鼠的生精功能，为进一步探讨镉的生殖毒性提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用健康清洁级10周龄SD雌性大鼠40只，10周龄SD雄性大鼠20只，雌、雄体重为(220±15)g，由重庆陆军军医大学实验动物中心提供。

1.2 主要试剂与仪器 氯化镉(CdCl2，分子量183.32，纯度99%，购自sigma有限公司，为分析纯)，M199培养基，匀浆液：0.5 mol/L NaCl，0.05% TritonX-100，0.25%硫柳汞混合液均为分析纯(sigma有限公司)； Multiskan FC型Thermo酶仪(广东丹利科技有限公司)；LKB-V超薄切片机(LKB生物有限公司)；721分光光度计(上海精密仪器仪表有限公司)；计算机辅助精子分析(CASA)仪(南宁松景天伦生物科技有限公司)；光学显微镜(日本Olympus公司)AA240Z石墨炉原子吸收仪(澳大利亚vanian公司)。

1.3 分组与处理 实验前，对动物室内大鼠进行饲养，并观察1周，无异常，于晚8时，雌雄按2∶l 的比例进行合笼，并于次日早晨8时，对雌鼠进行检查，当出现阴栓或者阴道涂片发现精子时，则判定为受孕，并记录为受孕0 d,获取孕鼠后独笼喂养。随机将孕鼠分为4个组,即对照组、低、中、高剂量染镉组，每组5只。自孕鼠第1天，用超纯水分别新鲜配制浓度为2、4、8mg/mL的氯化镉(CdCl2)溶液，采用灌胃方式染毒，对照组用等量生理盐水灌胃，低、中、高剂量组分别用对应浓度氯化镉灌胃(剂量分别为10、20、40 Mg/kg·d-1)，灌胃剂量为5 mL/( kg·d)，每天1次，直至哺乳期结束。待雄性仔鼠90日龄，从各组随机抽取10只雄性仔鼠断头处死，待检。

1.4 原子吸收法测定睾丸镉含量 (1)匀浆液(STI液)的配置：0.5 mol/L NaCl，0.05% TritonX-100，0.25%硫柳汞加双蒸水至1 000 mL。(2)标本制备：取左侧睾丸组织少许，置10%甲醛液中固定过夜。准确称取1g睾丸组织，加入制备的匀浆液(STI液)3 mL，4 ℃低温匀浆，匀浆后4℃离心机离心，10 000 rpm，离心10 min，取上清液-20℃冰箱保存备用。(3)标本硝化：①用微量加样器准确吸取500μL睾丸匀浆液于洁净的50 mL烧杯中，加入10mL浓硝酸硝化过夜；②硝化过夜睾丸匀浆液置40℃烘干器中蒸干，加入少许稀硝酸洗净烧杯中的残留物，加稀硝酸定容至10mL备用，直接用于检测。(4)样本检测：将制备好的样本均取250 μL加入到样品杯中，放置在原子吸收仪上检测。

1.5 脏器系数、生精功能指标检测 (1)脏器系数：动物处死后，立即摘取左、右睾丸，并称重，计算脏器系数(睾丸/体重×100%)。(2)睾丸每日精子生成量：取右侧睾丸，称重，去除睾丸白膜后，在10 mL匀浆液(STI液)中，使用电动玻璃匀浆机破碎睾丸实质组织，适当稀释后用血球计数板计数不被破坏的精子细胞头数，结果除以6.1即可算出每克睾丸每日精子生成量。(3)精子活动率和畸形率：处死动物后，使用眼科手术用剪刀，将附睾尾上的脂肪组织剔除，在37℃预温的M199培养基的培养皿中，沿着附睾尾的近侧端、远侧端，使用一次性手术刀，剪至输精管，深剪4～5刀，确保切口完全浸没在培养液中，避免将精子暴露在空气中。将含有精子的培养皿，放置于37 ℃二氧化碳培养箱中，精子扩散大约5 min，使精子从附睾尾中游出，将未充分扩散的大精子块及残余组织用尖头镊子剔除掉，取得精子悬液。使用M199培养液，按照1∶9进行稀释，轻轻摇晃混匀，通过CASA仪，进行精子活动率的测定并观察畸形精子数，并计算精子畸形率。(4)附睾精子计数：取右侧附睾尾，称重后充分剪碎，用生理盐水定容至50 mL，再稀释10倍后，用血球计数板法计数4大格精子数，除稀释倍数后计算每克附睾尾组织的精子数。(5)睾丸组织病理切片检查：HE 染色光镜观察。

2 结果

2.1 各组睾丸重量、脏器系数比较 与对照组相比，低、中、高剂量组的睾丸重量和脏器系数有所降低(P<0.05)，与低剂量组相比，中、高剂量组的睾丸重量和脏器系数都有所降低(P<0.05)。与中剂量组相比，高剂量组的睾丸重量和脏器系数都有所降低(P<0.05)。结果见表1。

表1 各组睾丸重量、脏器系数

*：与对照组相比，P<0.05；&：与低剂量相比，P<0.05；#：与中剂量组相比，P<0.05。

2.2 各组睾丸镉含量的比较 各组睾丸镉含量比较见表2和图1。低剂量组睾丸镉含量比对照组高(P<0.05)，中、高剂量组睾丸镉含量明显比对照组高(P<0.01)。与低剂量组相比，中剂量组的睾丸镉含量增高(P<0.05)，高剂量组的睾丸镉含量明显增高(P<0.01)。高剂量组睾丸镉含量大于中剂量组(P<0.05)。

2.3 各组睾丸生精功能指标的比较 与对照组相比，低剂量组的每日精子生成量、精子活动率、附睾精子计数降低，精子畸形率升高(P<0.05)，中、高剂量组变化明显(P<0.01)。与低剂量组相比，中剂量组的每日精子生成量、精子活动率、附睾精子计数降低，精子畸形率升高(P<0.05)，高剂量组变化明显(P<0.01)。与中剂量组相比，高剂量组的每日精子生成量、精子活动率、附睾精子计数明显降低，精子畸形率明显升高(P<0.05)。结果见表3。

表2 各组睾丸镉含量

*：与对照组相比，P<0.05；&：与低剂量相比，P<0.05；#：与中剂量组相比，P<0.05；a：与对照组相比，P<0.01；b：与低剂量相比，P<0.01。

图1 各组睾丸镉含量比较

表3 各组睾丸每日精子生成量、精子活动率、附睾尾精子计数和精子畸形率的比较

*：与对照组相比，P<0.05；&：与低剂量相比，P<0.05；#：与中剂量组相比，P<0.05；a：与对照组相比，P<0.01；b：与低剂量相比，P<0.01。

2.4 各组睾丸病理切片光镜检查结果比较 对照组睾丸组织层次分明、结构完整，曲细精管上皮各级生精细胞排列紧密，睾丸间质结构完整，见有正常的间质细胞，管腔内有较多量精子；与对照组相比，氯化镉低剂量组睾丸大部分曲细精管变化不大，仅有少数曲细精管生精细胞层次减少；中、高剂量组曲细精管呈不同程度的萎缩、变性，管内生精细胞数少或缺如，无精子形成或极少，管腔内可见坏死的细胞碎片，而且高剂量组病变更加严重。结果见图2。

A：对照组；B：氯化镉低剂量组；C：氯化镉中剂量组；D：氯化镉高剂量组；×400。图2 仔鼠睾丸病理切片分析

3 讨论

镉普遍存在于烟草和工业废水中，是污染环境的重金属毒物之一，同时，它还可以通过食物链，直接或者间接在人体中蓄积，对生殖系统造成不同程度地损伤[5]。有报道称，镉损伤了睾丸结构和精子的形成，并表现为明显的剂量—效应关系[6]，由于镉对生殖系统的毒性作用，导致精子数量减少和质量下降，将会造成雄性不育和雌性早产或流产。因此，研究孕期和哺乳期镉染毒对雄性仔鼠的生精功能的影响，为进一步探讨镉的生殖毒性提供参考依据。

在生殖毒理学实验中，观察实验动物的体重变化及测定睾丸的重量和脏器系数，是一个经济、灵敏且有效的指标，能够较好地反映化学毒物对该脏器的综合毒理作用。在本实验各染毒剂量组中，与对照组相比，低、中、高剂量组睾丸重量和脏器系数均降低，说明镉暴露对SD雄性仔鼠睾丸发育有一定影响。本研究还发现SD雄性仔鼠睾丸组织发生病理学改变，其病理变化是导致雄性仔鼠生殖功能改变的结构基础，表明镉对雄性仔鼠存在生殖毒性，同时也证实了睾丸是镉作用的重要靶器官，其可能机制是氯化镉染毒后，通过母体的胎盘屏障向子代转移镉并在睾丸蓄积，对睾丸造成损伤，导致生殖器官的发育受到了抑制[7-8]。每日精子生成量、精子活动度、附睾尾精子计数和精子畸形率是评价生精功能精子质量中常用指标之一，与对照组相比，各染镉组SD雄性仔鼠每日精子生成量、精子活动度、附睾尾精子计数均下降，精子畸形率增加，高剂量染镉组﹥中剂量染镉组﹥低剂量染镉组，表明镉对SD雄性仔鼠生精细胞生长和发育产生了毒性作用，随剂量增加，毒性作用增大；其机制可能是在精子形成期，镉对生长因子和相关生精酶的活性产生抑制作用，也可能是睾丸组织细胞结构受损导致睾丸萎缩或性激素睾酮的活性受到抑制作用而影响精子的正常发育[9-10]，从而导致生精功能受损。

综上所述，SD大鼠孕期、哺乳期镉暴露，可降低子代雄性大鼠的精子质量，可能影响生育功能。