李晓彤，曾凡群，任星桥，李叶丽，高 杨，杨丹莉

(遵义医科大学 基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 563099)

肺动脉高压(Pulmonary artery hypertension,PAH)是一种顽固性疾病，其特征是肺血管重构、肺血管阻力和肺动脉压逐渐升高，升高的肺动脉压会引起心脏结构的变化，接着是右心衰，最终死亡，其发生发展过程与肺血管重构密切相关[1]。肺动脉平滑肌细胞(Pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)的异常增殖是肺血管重构的主要因素[2]，因此抑制PASMCs增殖已经成为药物改善PAH的策略之一。

钙调神经磷酸酶(Calcineurin,CaN)是一种Ca2+和钙调蛋白依赖性丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶。活化的CaN促进PASMCs的增殖、迁移，促进PAH的发生、发展[3-4]。而增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)是DNA聚合酶δ的辅助蛋白,其水平与细胞增长率呈正比，在调节细胞增殖中起重要作用[5-6]。血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)能诱导PASMCs增殖、迁移。蛇床子素(Osthole,Ost)是一种天然香豆素化合物，从伞形科蛇床属植物蛇床的果实中提取的，其化学名为7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素[7]。已被证明具有多种有益的药理特性，如抗增殖、抗炎、扩张血管、抑制血栓形成、抗血小板聚集等[8-9]。课题组前期研究发现：对野百合碱诱导的大鼠PAH模型，Ost具有降低肺动脉压和改善肺动脉重构、肺动脉周围及肺间质炎症等作用[7]。故本研究以原代培养的大鼠PASMCs为研究对象，基于CaN探讨Ost抑制PDGF-BB所致的PASMCs增殖作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级雄性SD大鼠，体重180～200g，采购于陆军军医大学实验动物中心(许可证：SCXK-(军)2012-0011)。

1.2 药品、试剂和仪器 蛇床子素(纯度≥99.90%，MCE)；PDGF-BB(美国，R&D公司)；胎牛血清、0.25%胰酶、DMEM-F12(美国，Gibco公司)； CCK-8增殖检测试剂盒(日本，同仁化学)；FITC标记的山羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠α-SMA(武汉，博士德公司)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)、PCNA兔抗大鼠抗体(武汉，三鹰生物)；CaN兔抗大鼠抗体(美国，Abcam公司)；牛血清白蛋白、二硫苏糖醇、Ⅰ型胶原酶、木瓜蛋白酶(美国，Sigma公司)；超净工作台(苏州，净化设备厂)、倒置荧光显微镜(日本，OLYMPUS公司)、Mini Trans-Blot转移系统(美国，BIO-RAD公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 大鼠PASMCs的原代培养 参考文献[2]方法，SD大鼠采用颈椎脱臼法处死，无菌条件下游离心肺组织，快速分离肺动脉血管中层，用眼科剪将肺动脉剪成小碎块，转移至15 mL离心管，加入联合消化酶，放置37℃水浴摇床，消化约40 min， 1000 rpm离心7 min，弃培养基收集沉淀，加入含20% FBS的DMEM-F12培养液，置于37℃、体积分数5% CO2孵箱培养。

1.3.2 PASMCs的鉴定 收集处于对数生长期的第三代PASMCs；以1×105/mL个细胞接种于6孔板，24 h后细胞贴壁生长良好，弃掉培养基，用预冷的PBS清洗，3 min×3次；4 %多聚甲醛室温固定20 min，预冷的PBS清洗，3 min×3次；0.3% Triton-X-100室温透化破膜10 min，预冷的PBS清洗，3 min×3次；山羊血清室温封闭30 min，弃去山羊血清，加兔抗小鼠α-SMA抗体在4℃孵育过夜，预冷的PBS清洗，3 min×3次；避光加入FITC标记山羊抗小鼠室温1 h，预冷的PBS清洗，3 min×3次；DAPI 室温10 min避光进行复染核，预冷的PBS清洗，3 min×3次，倒置荧光显微镜观察结果并拍照。

1.3.3 实验分组及给药 将生长状态良好的PASMCs分为5组：①正常对照组(Control组)：不加药物；②模型组(Model组)：加入25 ng/mL 的PDGF-BB；③Ost-L组：同时加入25 ng/mL的 PDGF-BB和5 μM的Ost；④Ost-M组：同时加入25 ng/mL的PDGF-BB 和10 μM的Ost；⑤Ost-H组：同时加入25 ng/mL的PDGF-BB+20 μM的Ost，共同作用24 h。

1.3.4 CCK-8法检测细胞增殖活力 收集处于对数生长期的PASMCs(6×104/mL)接种于96孔板，每孔100 μL。培养过夜，去除培养基，用1% FBS培养基同步12 h，按照实验分组处理24 h。将10 μL CCK-8试剂加入每个孔中，放置37℃孵育1.5 h，使用酶标仪测量450 nm处的吸光度，每组设置5个复孔，实验重复5次。

1.3.5 蛋白免疫印迹法检测PCNA、CaN蛋白的表达 收集处于对数生长期的PASMCs(1×105/mL)接种于6孔板，待细胞贴壁，用1% FBS培养基同步12 h化，按照实验分组处理24 h，弃培养液，预冷PBS洗涤3次，加RIPA裂解液提取总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳分离蛋白，转膜，5 %脱脂牛奶室温封闭2 h，加入稀释一抗(PCNA 1∶2 000，CaN 1∶2 000，β-actin 1∶5 000，GAPDH 1∶10 000)4 ℃孵育过夜，室温TBST洗3次，每次10 min。加入结合了HRP的二抗室温孵育1 h，室温TBST洗3次，每次10 min。使用ECL底物观察条带，Bio-Rad化学发光成像系统拍取图片。每组设置5个复孔，实验重复4次。

2 结果

2.1 PASMCs的形态观察 在倒置显微镜下观察培养第3天的原代PASMCs，可见少许细胞贴壁，第7天可见细胞交织成网为长梭形、三角形或多角形，呈典型的“峰-谷”状排列生长(见图1)。

A：原代PASMCs第3天；B：原代PASMCs第7天呈现“峰-谷”样生长状态(×100)。图1 原代PASMCs培养生长情况

2.2 PASMCs的鉴定 传代后的原代PASMCs，选对数生长期的第三代细胞进行免疫荧光鉴定，倒置荧光显微镜下观察有较强的绿色荧光在细胞胞浆中，α-SMA呈阳性反应，表明培养的细胞为PASMCs，细胞核在DAPI标记后呈椭圆形蓝色荧光(见图2)。

A:α-SMA;B:DAPI;C:Merge。图2 PASMCs免疫荧光法染色(×200)

2.3 Ost对PASMCs增殖活力的影响 CCK-8法检测各组PASMCs增殖活力，与Control组比较，Model组细胞增殖活力明显升高(P<0.05)，与模型组比较， Ost-M、Ost-H组细胞增殖活力则有不同程度的降低(P<0.05)，以Ost-H组效果更明显(见图3)。

*：P<0.05 vs Control； #：P<0.05 vs 图3 Ost对PDGF-BB所致PASMCs增殖的影响

2.4 Ost对PASMCs中PCNA表达的影响 与Control组比较，Model组PDGF-BB明显增加PASMCs中PCNA蛋白的表达(P<0.05)；表明PDGF-BB促进了PASMCs的增殖；与Model组比，Ost-M、Ost-H组降低PASMCs中PCNA蛋白的表达(P<0.05)，以Ost-H组效果更明显，表明Ost对PDGF-BB诱导PASMCs增殖具有抑制作用(见图4)。

*：P<0.05 vs Control； #：P<0.05 vs 图4 Ost对PDGF-BB所致PASMCs中PCNA蛋白表达的影响

2.5 Ost对PASMCs中CaN表达的影响 与Control组比较，Model组PDGF-BB明显上调PASMCs中CaN蛋白的表达(P<0.05)。与Model组比，Ost-M、Ost-H浓度组显著抑制PDGF-BB所致PASMCs中CaN蛋白表达上调(P<0.05)，以Ost-H浓度组抑制作用更明显(见图5)。

*：P<0.05 vs Control；#：P<0.05 vs 图5 Ost对PDGF-BB所致PASMCs中CaN蛋白表达的影响

3 讨论

PAH是发病机制复杂、预后差的心肺血管疾病。肺小动脉重构是导致PAH产生的重要原因[10]。其中，PASMCs的过度增殖所致的肺血管阻力增加，是导致肺动脉重构的重要因素[9]。平滑肌α-SMA蛋白是PASMCs表达的特征蛋白，通过倒置荧光显微镜观察，本实验条件下培养的PASMCs胞浆中α-SMA呈绿色荧光阳性反应，细胞形态为长梭形、三角形或多角形，呈典型的“峰-谷”状排列生长提示原代大鼠PASMCs培养成功。

PDGF-BB是血小板衍生生长因子(PDGF)家族成员之一，是有效的促细胞分裂因子，与血小板衍生生长因子受体(PDGFR)结合发挥起作用，参与细胞增殖和迁移。在PAH患者和动物的肺组织中发现了PDGF和PDGFR的表达增加[11]。PDGF-BB能诱导PASMCs的增殖和迁移，促进肺动脉重构[12]，故本研究中用PDGF-BB诱导原代PASMCs的增殖。PCNA是DNA聚合酶δ的辅助蛋白,是细胞增殖的标志性蛋白[5-6]。本研究中，与Control组相比，Model组细胞增殖活力明显增加，PCNA蛋白表达显著上调，表明PDGF-BB诱导的PASMCs增殖模型成功。而给予中、高浓度Ost处理，可明显抑制PDGF-BB所诱导的PASMCs的增殖活力的增加和PCNA蛋白表达的上调。此外，本课题组流式细胞仪检测细胞周期，发现PDGF-BB使PASMCs增殖指数增高，Ost抑制其增殖。以上结果均说明Ost具有抑制PASMCs的增殖作用。

CaN是异二聚体，由其催化亚基CaNA和调节亚基CaNB组成的。在病理因素的影响下，细胞质中钙含量增加，调节亚基CaNB的钙结合位点与钙发生结合，进而引起CaNA构象变化，使其磷酸酶活性位点暴露出来，并与CaM结合牢固，进而激活CaN[13]。活化的CaN在参与细胞增殖、分化过程中，以及PAH的发生发展中发挥重要作用。有趣的是，在慢性缺氧和野百合碱诱导的PASMCs增殖模型中，CaN的激活刺激PASMCs的增殖，从而加剧了肺小动脉重构[4,14]。本实验给予PDGF-BB干预原代培养的PASMCs 24h后，发现PDGF-BB可上调CaN蛋白表达水平，而中、高浓度的Ost可显著抑制PDGF-BB所致的CaN蛋白表达水平的上调。

结合以上分析，提示Ost抑制PDGF-BB诱导的PASMCs增殖与其下调CaN蛋白的表达相关。