张 璐，朱晓鹏，长孙东亭，罗素兰

(海南大学 海洋学院/热带生物资源教育部重点实验室/海口市海洋药物重点实验室，海口 570228)

烟碱型乙酰胆碱受体(Nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs)是一种由五聚体亚基组成的配体门控离子通道，可分为神经型nAChRs和肌肉型nAChRs。目前，研究较多的神经型nAChRs的亚型有：α3β2，α3β4，α4β2，α6/α3β2β3，α7，α9α10等；肌肉型nAChRs有α1β1δγ和α1β1δε2类[1]。神经型nAChRs与一系列神经生理和病理过程密切相关[2]。β亚基作为一种重要的辅助型亚基，与α亚基结合，形成五聚体结构，协同作用发挥配体门控离子通道的功能。包含β亚基的nAChR广泛存在于中枢和外周神经系统中，目前，已发现多种疾病与β亚基的功能相关，如：疼痛，帕金森氏症，抑郁症，阿尔茨海默症，药物成瘾及脑损伤修复等[3-8]。β亚基上氨基酸的变化会造成nAChRs功能的变化，从而导致疾病的发生。有研究发现，夜间额叶癫痫症就是因为nAChR上的β2亚基第287位的缬氨酸发生了突变，影响了离子通道的活性，导致出现癫痫症状[9]。 定点突变技术是目前研究目的蛋白中关键氨基酸的一种常用技术，利用定点突变技术能定向对关键氨基酸进行突变，研究目的蛋白中关键氨基酸的作用，以及发现配体与受体相互作用的关键位点。如： ZHANGSUN D等[10]选择5个鼠源(rat)β2亚基上的氨基酸位点设计了点突变体，并选择α-芋螺毒素LvIA(α-Conotoxin LvIA，简称α-CTx LvIA)为探针，检测突变型nAChR药理学特性的变化，研究发现，胞外N端第59和119位2个重要氨基酸位点突变后，受体对α-CTx LvIA的结合活性增强。CUNY H等[11]也利用了定点突变的方式探究α-CTxs与nAChRs结合的关键氨基酸位点，结果发现，β2亚基上胞外N端第59和113位氨基酸改变后，受体对α-CTxs的敏感性会发生改变。α3β4 nAChR亚型是治疗尼古丁依赖、药物滥用、小细胞肺癌、过度饮食和肥胖的潜在靶点[12-14]。β4亚基上的关键氨基酸对β4的病理、药理活性具有重要作用，也是许多配体药物作用的重要靶点。研究β4亚基上的关键位点信息，对于配体药物及先导化合物的研究具有重要意义。有研究表明，β4亚基上Loop F区域的氨基酸位点可以影响受体与激动剂和拮抗剂的结合[11]。Loop F中第168位的异亮氨酸(Ile)是β4亚基与β2亚基的区分性位点，体现出β4亚基的药理学特性。笔者利用PCR介导的定点突变技术，选择β4亚基上胞外N端配体结合域Loop F中第168位的异亮氨酸(Ile)进行定点突变，构建包含β4亚基的烟碱型乙酰胆碱受体点突变体模型，并利用双电极电压钳技术对激动剂ACh和拮抗剂α-CTx RegIIA对突变受体的活性进行检测，旨在为研究β4亚基中关键氨基酸的作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞由本实验室保存；含有α3，β4 nAChRs亚基基因的质粒获赠于美国犹他大学。乙酰胆碱(ACh)、胶原酶A购自美国Sigma-Aldrich公司；质粒提取试剂盒(OMEGA)，PCR突变试剂盒(Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit)，cRNA体外转录试剂盒mMESSAGE mMACHINE Kit，RNA产物回收试剂盒MEGA clear Kit等购自美国ThermoFisher Scientific公司；质粒线性化所需的多种限制性内切酶等购自宝生物(大连)有限公司；ND96生理缓冲液：96 mmol·L-1NaCl，2 mmol·L-1KCl，1.8 mmol·L-1CaCl2，1 mmol·L-1MgCl2，5 mmol·L-1HEPES，pH7.3～7.7；突变引物的合成和突变体的测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。实验用雌性非洲爪蟾(Xenopuslaevis)由美国进口(Nasco)。

1.2 突变体引物的设计针对鼠源β2和β4 2种亚基在胞外N端配体结合区的氨基酸序列进行对比，选择亚型特异性的差异氨基酸位点作为突变对象。本实验中选择的是鼠源β4亚基胞外N端氨基酸序列第168位的异亮氨酸(Ile)，将该位点突变成鼠源β2亚基对应位置的丝氨酸(Ser)，可作为研究2种亚型特异性的1种模型。利用Primer Premier 5.0软件设计突变位点的上下游引物(表1)。

表1 突变位点上下游引物序列

1.3 PCR介导的定点突变以包含鼠源β4亚基序列的质粒为模板，采用PCR介导的定点突变技术对β4亚基上第168位氨基酸进行定点突变。包含突变位点的1对引物和模板质粒退火后用高保真聚合酶进行扩增。PCR反应条件为：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性20 s，60 ℃退火10 s，延伸阶段68 ℃ 3 min，末次循环阶段68 ℃ 2 min，共25个循环。正反向引物的延伸产物退火后配对成为不完整的开环质粒。PCR扩增得到的产物用w=0.8%琼脂糖凝胶进行电泳检测，电压为90 V，经过15 min，观察电泳结果。在PCR产物中加1 μL Dpn Ⅰ酶、37 ℃水浴消化质粒模板，Dpn Ⅰ酶除去模板质粒。开环质粒转入DH5α感受态细胞后，选取单克隆，培养后提取质粒。通过测序确定目标位点是否突变正确。

1.4 突变体RNA的制备大量提取突变正确的突变体质粒，使用限制性内切酶Xho Ⅰ进行酶切，获得线性化模板。酶切产物纯化后，使用w=0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，保留纯度和浓度符合要求的线性化DNA作为体外转录的模板，利用T3体外转录试剂盒进行体外转录。20 μL反应体系：1～1.5 μg 模板，

2 μL 10×Reaction Buffer，10 μL 2×dNTP，1 μL逆转录酶，37 ℃，体外转录4 h，获得对应基因的cRNA。此外，为了消除质粒模板的影响，使用DNAse酶处理转录产物。cRNA经RNA纯化试剂盒纯化后，利用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳，检测cRNA的浓度和纯度，确定是否符合显微注射的要求。

1.5 非洲爪蟾卵母细胞获取和显微注射麻醉非洲爪蟾1 h后，取出成团卵母细胞，胶原酶酶解后，分离获得单个卵母细胞(图1)。β4亚基突变体cRNA和β4亚基本体cRNA分别与α3亚基cRNA(1∶1)混合，显微注射到爪蟾卵母细胞，注射RNA体积为每个卵母细胞注入59.8 nL RNA。经注射cRNA的卵母细胞在含抗生素的ND96生理缓冲液中，17 ℃培养2 d后进行电生理活性检测。

1.6α3β4nAChR及其突变体的药理活性检测非洲爪蟾卵母细胞注射cRNA 2 d后，置于50 μL细胞槽中，室温下，利用双电极电压钳进行检测。卵母细胞的钳制电位为-70 mV。用作重力灌注的ND96缓冲液流速为2 mL·min-1。卵母细胞每分钟给予1 s 100 μmol·L-1ACh刺激，以引起内向电流产生。基线稳定后，停止灌流，在细胞槽中加入5 μL ND96生理缓冲液或5 μL不同浓度的α-CTx RegIIA溶液(从低浓度到高浓度：10-9，10-8，10-7，10-6，10-5mol·L-1)，静置5 min后，开启记录模式，记录不同孵育条件下受体电流的变化。

1.7 数据统计ND96溶液孵育非洲爪蟾卵母细胞5 min后，以100 μmol·L-1ACh刺激1 s引发的电流作为基础电流(记录3次，取平均值作为标准电流值)。不同浓度α-CTx RegIIA孵育卵母细胞5 min后，记录100 μmol·L-1ACh诱发的电流值作为反应电流值(反应率=反应电流值/标准电流值)。根据不同浓度α-CTx RegIIA引发的电流反应值，计算它对受体的半数阻断剂量(IC50)。剂量反应曲线符合非线性拟合方程：

反应率=100 /(1+([toxin] / IC50)nH)，

式中，nH是Hill系数，[toxin]代表α-CTx RegIIA的浓度，IC50是半阻断浓度。

利用GraphPad Prism(GraphPad Software，San Diego，CA)软件进行分析和作图。每个数据点至少包含3个以上卵母细胞的统计值。

2 结果与分析

2.1 突变体PCR产物电泳图从图2可知，孔道1(加入的是突变体PCR产物)扩增条带在5 000 bp附近，符合目的条带长度，且条带清晰明亮，可用于下一步转化实验。

2.2 突变体质粒测序突变体质粒的测序结果和NCBI比对结果如图3所示。β4亚基N端配体结合区第168位密码子ATC(Ile)突变为密码子AGT(Ser)，定点突变准确无误。

2.3 cRNA制备从图4可知，孔道1(突变体质粒)的条带在3 000 bp附近，孔道2(质粒酶切后产物)的条带在5 000 bp附近，孔道2条带滞后于孔道1条带，说明质粒酶切完全。突变体线性模板的质量浓度为478.3 mg·L-1，A260/280比值为1.84；经过纯化后，产物的A260/280比值为1.81，纯度更好，质量浓度为549.5 mg·L-1(表2)。线性质粒符合体外转录模板的要求。体外转录收获50 μL洗脱产物，紫外分光光度计测定突变体cRNA的质量浓度为698.1 mg·L-1，A260/280比值为2.12，符合纯度要求，可用于卵母细胞注射(表2)。

图3 包含定点突变β4亚基序列的质粒测序结果和序列比较图

AGT represents the base corresponding to the amino acid at position 168 of theβ4 subunit after mutation, and ATC represents the base corresponding to the amino acid at position 168 of theβ4 subunit before the mutation

表2 突变体质粒，线性DNA，cRNA的浓度和A260/280比值

2.4 突变型受体与本体由乙酰胆碱ACh激发的电流比较以相同浓度100 μmol·L-1ACh作用于非洲爪蟾卵母细胞1 s，引起了内向电流，说明α3β4和α3β4[I168S] nAChR受体模型成功表达。α3β4和α3β4[I168S] nAChR受体模型的电流大小如图5所示，结果发现，相同条件下，本体对100 μmol·L-1ACh激动剂引发的开放电流为(690.4±136.5 )nA(n=6)，突变体对100 μmol·L-1ACh的诱发电流为(342.6±55.64)nA(n=15)，经比较，2种电流差异显著(P<0.05)。

2.5 突变型受体与本体的药理活性检测利用拮抗剂α-CTx RegIIA对α3β4 nAChR本体和突变体的活性进行研究(图6)，红色曲线代表本体的剂量反应曲线，黑色曲线代表突变体的剂量反应曲线，突变体向右移，证明受体的活性降低。从表3可知，α-CTx RegIIA对α3β4 nAChR本体IC50值为120 nmol·L-1，而对突变体α3β4[I168S]nAChR的IC50值较本体增大了1.4倍，为170 nmol·L-1。证明168位发生突变后，α-CTx RegIIA对α3β4 nAChR的结合活性减弱。

表3α-芋螺毒素RegIIA对本体和突变体的半阻断浓度

Tab.3 TheIC50values for block of wildtype and mutant nAChRs byα-CTx RegIIA

受体类型nAChR subtypes半数阻断浓度IC50 /(nmol·L-1)比值RatioHill系数Hillslopeα3β4120 10.8 α3β4[I168S]170 1.41.1

注：比值=突变体IC50/本体IC50

Note: ratio= mutantIC50/wildtypeIC50

3 讨 论

不同亚型的nAChRs是许多疾病及相关新药研发的重要靶点。因此，研究nAChRs各种亚型的精细结构对阐明nAChRs结构及功能的关系，揭示配体药物与nAChRs相互作用的分子机制，以及研究nAChRs相关疾病的病理和生理过程至关重要。α3β4 是nAChRs中重要的1种亚型，它广泛分布于外周神经系统和中枢神经系统的内侧缰核、脚间核、后屈束、松果体等组织中，主要参与调节突触间多种神经递质的释放[15]。吴勇等的研究结果表明，针对α3β4 nAChR亚型的选择性阻断剂AT-1001，18-MC和α-CTx AuIB能够降低大鼠模型的烟碱释放作用[16]；下丘脑中的α3β4 nAChR还参与烟碱介导的食欲降低过程[17]。此外，α3β4nAChR还与许多疾病的药理和生理作用相关，如小细胞肺癌、机械性损伤修复、疼痛、成瘾等。

β4亚基作为α3β4nAChR中的1个关键亚基，不仅参与生理和病理过程的调控，还是许多配体药物作用的重要靶点。但是，目前药物是如何通过β4亚基参与神经调控的分子机制尚不清楚，而氨基酸定点突变技术可以确定β4亚基上关键氨基酸位点以及阐明药物作用的精细分子机制。有研究表明：突变β4亚基 Loop F上D191，D192位天冬氨酸(Asp)会降低受体对激动剂Epi和CCh的活性，从而说明了在β4亚基和激动剂结合作用中，191，192位点是β4亚基上关键氨基酸位点[18]。本实验利用PCR介导的定点突变技术，把位于β4亚基中与配体结合关键区域Loop F上的第168位异亮氨酸(Ile)，突变成了β2亚基中对应位点的丝氨酸(Ser)，该突变体对于研究α3β2和α3β4两种亚型的敏感性差异具有重要意义。Ile突变成Ser后，氨基酸由非极性氨基酸转变成极性氨基酸，疏水性发生了变化，导致该位点形成的口袋结构发生了变化，对激动剂和拮抗剂的活性也随之改变。笔者选取激动剂ACh和拮抗剂α-CTx RegIIA研究突变体受体的药理学活性，与本体比较，相同浓度ACh刺激突变受体激发的电流值比本体减小，α-CTx RegIIA对突变体活性减弱。该位点在其他激动剂和拮抗剂的结合中是否具有相同影响，还有待进一步研究。