松藻主要生物活性物质研究进展

2019-01-17彭雍博张雪楠王俊鑫何云海汪秋宽

水产科学 2019年1期

胡月，彭雍博，张雪楠，王俊鑫，何云海，汪秋宽

( 大连海洋大学食品科学与工程学院，国家海藻加工技术研发分中心，辽宁水产品加工及综合利用重点实验室，辽宁大连 116023 )

松藻是松藻属(Codium)藻类的总称，属绿藻门、绿藻纲、管藻目、松藻科[1]，是一种世界性泛暖温带绿藻[2]，其藻体呈黑绿色，呈叉状分支[3]。松藻属藻类共计50余种，我国沿海则有刺松藻(C.fragile)、长松藻(C.cylinricum)、杰氏松藻(C.geppii)、平卧松藻(C.repens)等11种，主要分布于南海沿岸[4-5]。据《中国海藻志》记载，松藻具有清热解毒、消肿利尿、驱虫、清肠胃等功效[6]。基本成分研究表明，松藻藻体中含有丰富的糖类、蛋白质、脂肪酸及微量元素等。松藻多糖主要有3种，分别为位于细胞间质中的水溶性硫酸多糖，由木聚糖或甘露聚糖构成的细胞壁微纤维和细胞质内少量的其他多糖。松藻蛋白氨基酸分析发现，松藻蛋白主要由天冬氨酸、谷氨酸等18种氨基酸组成，其中苏氨酸等8种必需氨基酸约占氨基酸总含量的45%。此外，松藻中不饱和脂肪酸含量较高，约占脂肪酸含量的50%。松藻还含有丰富的微量元素，尤以Cu、Fe、Zn为主[7-10]。松藻作为重要的海洋药物资源，含有丰富的多糖、糖蛋白、甾醇类、萜类、管藻黄素、纤溶酶等活性物质，具有抗凝血、抗病毒、免疫调节、抗肿瘤等功效[11-19]，而对其生物活性物质的提取、结构解析和构效关系等研究鲜有报道。

松藻本源可能是日本，而现今已遍布世界多地，包括英国、美国、澳大利亚、智利、新西兰等地[20-24]。其中，刺松藻繁殖力强，并具有宽泛的环境适应力和耐受力，可与其他物种竞争光照、营养以及空间资源，所以刺松藻被认为是松藻属中威胁生态系统的主要物种之一[25-26]。Hanisak[27]对刺松藻生长的影响因素研究发现，刺松藻在6～33 ℃能够正常生长，而环境盐度要求主要依赖于温度条件，即当温度不利于其生长时，适应盐度范围变小，温度利于其生长时，盐度范围适量变大。另外，光照和温度对刺松藻的生长的影响则存在交互效应，即藻体在高温度低光照下会出现光饱和现象，抑制藻体的生长。Gerard等[28]研究则证明，硝酸盐、亚硝酸盐、铵盐或尿素等，均可以作为松藻的良好的氮源，因此近海水体富氮为松藻的生长提供了适宜的繁殖环境。笔者对松藻生物活性物质提取工艺、结构解析、生物活性、应用等方向进行概述，以期为松藻的综合开发提供理论支持。

1 松藻多糖提取及其活性研究

1.1 松藻多糖提取工艺

目前，松藻多糖的提取方法主要有水提法、碱提法和酶提法。水提法主要分为冷水提法和热水提法。其中热水提法作为植物多糖提取的经典方法，常被应用于海藻粗多糖的提取。此法成本低，操作简便，但提取率低、纯度低、活性损失较大、提取时间长，难以应用于海藻多糖的规模化生产[29]。熊皓平等[30]通过单因素及正交试验优化了长松藻多糖水提法提取工艺，最佳提取条件为：提取温度95 ℃、提取时间1.5 h、料水比1∶50(m∶m)，多糖得率为9.79%。此外，于广利等[31]分别通过冷水和热水提取刺松藻多糖，经分离纯化后得到11种组分，测定结果证明热水提取组分比冷水提取组分的分子量大，葡萄糖含量高，但硫酸基含量较低。

碱提法是通过碱液作用使藻类细胞吸水膨胀破裂，游离出多糖。此法能够明显提高多糖提取率，但多糖的结构和活性易遭受破坏，这限制了碱提法的推广应用，但近年来也有相应的改进工艺应用[32]。李娜[33]依次采用冷水、热水、和0.50 mol/L NaOH溶液提取叉开松藻(C.divaricatum)多糖，多糖得率可达20.67%，此法不仅可以提取细胞间质细胞内的多糖，还可以进一步提取酸性多糖，同时避免了碱提法对多糖结构的破坏。

酶提法以热水浸提法为基础，辅以酶制剂提取海藻多糖，此法绿色环保、简易、快捷，已被运用于陆地及海洋中多种生物活性物质的提取[34]。Rodrigues等[35]发现，酶解法的软毛松藻(C.tomentosum)多糖提取率高于水提法，纤维素酶和戊聚糖聚合酶的松藻多糖提取率可达60%和62%。Kulshreshtha等[36]分别比较了水提法和酶解法提取刺松藻多糖发现，酶解法能显著提高多糖提取率，且酶提法相较于水提法，不仅提取率提高了20%～35%，且能够促进蛋白质、中性糖、尿酸和硫酸盐的恢复，对抗单纯疱疹病毒的活性也显著提高。但目前对松藻多糖的酶解法提取的研究较少，未来仍需加强松藻多糖酶解法的研究。

综上所述，松藻多糖的提取技术相对单一，仅有水提法、碱提法以及酶提法被应用于松藻多糖的提取。对于现阶段被广泛利用的微波辅提法、超临界流体萃取法以及多种简单方法的联用技术在松藻多糖中的应用尚未见报道，因此仍需要广大科研工作者进一步探索[37]。

1.2 松藻多糖结构解析

松藻多糖主要分布在植物细胞壁中，另有少量分布于细胞质内。细胞壁中的松藻多糖主要由木聚糖或甘露聚糖组成，细胞质内的松藻多糖多为葡聚糖[38]。此外，松藻多糖的基本组分和单糖组成因藻种、提取方法的不同表现出显著性差异(表1)。冯以明[39]对刺松藻等中提取的多糖研究发现，与其他藻类及陆生植物的细胞壁组分不同，β-D-1,4-甘露聚糖是松藻细胞壁微纤维的主要成分。此外，水溶性硫酸化多糖作为松藻多糖的主要活性成分分为两种：一种是硫酸阿拉伯聚糖，另一种是硫酸阿拉伯半乳聚糖[40]。早期，Love等[41]指出，松藻多糖主要由硫酸化的阿拉伯半乳聚糖、甘露聚糖以及淀粉组成。随着松藻多糖结构研究的不断深入，邱玉明[42]通过气相色谱法发现，长松藻的主要单糖组成依次为半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖及葡萄糖，同时还含有少量的鼠李糖；PMP柱前衍生高效液相色谱研究结果同样表明，叉开松藻多糖的单糖组成为半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖，研究结果还发现叉开松藻多糖的主要单糖阿拉伯糖和半乳糖的构型分别为L和D[33]。Konstantina等[13]采用气质联用技术分析刺松藻多糖也证明，松藻多糖主要是由半乳糖和阿拉伯糖组成，同时还含有少量的葡萄糖、阿洛糖(葡萄糖的C-3差向异构体)、阿卓糖(甘露糖的C-3差向异构体)、甘露糖、木糖和鼠李糖。

傅里叶红外光谱技术对长松藻多糖的结构研究则发现，长松藻多糖不仅具有一般多糖的红外吸收峰，在845 cm-1和820 cm-1处还有C4和C2位置的硫酸根特征吸收峰，结果证明松藻多糖是一种硫酸化多糖[42]。Ciancia等[43]的核磁氢谱及碳谱研究表明，刺松藻多糖同时含有α和β半乳吡喃糖环。Fernández等[44]则指出，松藻多糖空间结构复杂，至少含有3种类型，即高度硫酸化和丙酮酸化的β(1→3)-D半乳聚糖、硫酸化的β(1→3)-L阿拉伯聚糖和β(1→4)-D甘露聚糖。Farias等[45]对腰肢松藻(C.isthmocladum)的研究发现，腰肢松藻中硫酸化半乳糖主要由C4位置连接硫酸根基团的3-β-D-吡喃半乳糖组成。Fernández等[46]对虫状松藻(C.vermilara)细胞壁多糖分析结果则表明，虫状松藻多糖23%的甘露糖的C2位置链接硫酸根基团。

1.3 松藻多糖的活性

松藻多糖具有较强的抗凝血作用，早期研究表明，硫酸化的海藻多糖一般具有较强的心血管疾病治疗效果，同样松藻多糖作为一种硫酸化的多糖，其抗凝血活性已被大量文献报道。Hiral等[11]发现，松藻多糖可以显著延长活化部分凝血活酶时间、血浆凝血酶原时间，分别延长18.6%、10.3%，同时对血小板聚集抑制率可达35.7%。Jurd等[47]也将活化部分凝血活酶时间、血浆凝血酶原时间、凝血酶时间作为评价指标，对刺松藻多糖体外抗凝血活性做出评价。结果表明，刺松藻多糖的抗凝血效果与其含量和硫酸根含量有关，且抗凝机制主要是通过增强肝素辅酶Ⅱ和抗凝血酶Ⅲ的活性。Matsubara等[48]则发现，长松藻中提取的硫酸化半乳聚糖能够延长活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间，而血浆凝血酶原时间不受影响，同时研究也指出，长松藻多糖的抗凝血活性类似于肝素，但弱于肝素，且这种作用机制主要是通过抑制纤维蛋白聚合物或内源性凝血。而Siddhanta等[40]比较来源自松藻(C.dwarkense)的硫酸化阿拉伯聚糖和硫酸化阿拉伯半乳聚糖的抗凝血活性发现，同质量浓度下松藻硫酸化阿拉伯聚糖的抗凝血效果优于硫酸化阿拉伯半乳聚糖。

研究发现，松藻多糖具有广泛的病毒抑制作用[49]。邱玉明[42]对长松藻多糖的体外抗病毒活性进行研究发现，长松藻多糖对单纯疱疹病毒Ⅰ型、柯萨奇病毒B3型均有一定抵抗作用，其半抑制质量浓度分别为7.81、3.91 μg/mL。Lee等[50]的体外抗病毒活性试验表明，扁平松藻(C.adhaerens)中的硫酸化阿拉伯糖同样具有抗病毒活性，对单纯疱疹病毒Ⅰ型的半抑制质量浓度值为6.90 μg/mL，且药敏试验表明，扁平松藻多糖对侵入宿主细胞的单纯疱疹病毒Ⅰ型也具有抑制作用；后续研究指出，扁平松藻硫酸化阿拉伯糖的抗病毒活性主要与硫酸根含量有关。Ohta等[12]对刺松藻硫酸化半乳糖的抗病毒研究结果证明，该糖不仅可以抑制单纯疱疹病毒Ⅱ型的复制，也可直接减少单纯疱疹病毒Ⅱ型的感染率。

刺松藻多糖具有显著的免疫调节活性，不仅可以激活非特异性免疫系统(促进巨噬细胞、自然杀伤细胞增殖)、还可以诱导特异性免疫系统(促进B细胞、T细胞增殖分化，及效应B细胞、效应T细胞活力)[51]。Konstantina等[13]通过Westblot试验比较了刺松藻多糖和肝素对细胞因子IL-2、IL-7和INF-γ的作用效果发现，刺松藻多糖可抑制IL-2、IL-7和INF-γ的产生，抑制率分别为59%、58%和40%。Lee等[52]指出，松藻中的丙酮酸化硫酸半乳糖能够刺激NO的产生，同时还能促进促炎因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α和抗炎因子IL-10产生，说明该多糖可以激活巨噬细胞产生体外免疫。

作为纯天然多糖，刺松藻多糖具有抗肿瘤作用。吴荣杰等[4]在研究刺松藻多糖对肺癌A549细胞体内和体外的抑制效果时发现，1000 μg/mL的刺松藻多糖对A549细胞生长体外抑制率为21%，同时能显著增强淋巴细胞增殖和巨噬细胞吞噬活性；动物试验结果则证明，刺松藻多糖对荷瘤小鼠的抑瘤率最高为43%。王培胜等[14]研究刺松藻多糖对小鼠肝癌细胞Hca-F的生长抑制作用机制研究结果表明，200 mg/kg的刺松藻多糖对小鼠Hca-F细胞的抑制率可达31.93%，分析认为可能与该多糖提高了荷瘤小鼠机体的免疫活性有关。

松藻多糖还具有抗血管生成、吸湿保湿以及抗氧化等生物活性。Matsubara等[53]证实，长松藻多糖能够在无血清基质培养模型中抑制大鼠主动脉微血管的生成，而5 μg/mL时能显著抑制人脐静脉内皮细胞在重组基底膜凝胶上的形成。宋厚芳[9]则指出，刺松藻多糖具有吸湿保湿作用，且保湿效果与多糖硫酸根含量呈正相关；同时也发现，刺松藻多糖还具有较高的抗氧化活性，对超氧自由基、羟基自由基的清除能力均高于同剂量水平下的维生素C。

2 其他生物活性物质研究

除多糖以外，松藻中的糖蛋白也具有抗氧化、抗凝血等功效。Senthilkumar等[54]的抗氧化研究表明，刺松藻糖蛋白对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、羟基自由基、超氧自由基、NO均具有较强的清除能力，清除率分别为33.94%、31.80%、18.10%和27.43%，且清除效果随着质量浓度的增大而增强。Jurd等[15]从刺松藻中分离出一种高分子量的硫酸化糖蛋白，抗凝研究发现，松藻糖蛋白能够通过增强肝素辅因子Ⅱ和抗凝血素Ⅲ活性呈现抗凝功效，且这种抗凝血作用与药物含量及硫酸根含量成正比。Thangam等[16]研究了脱皮松藻(C.decorticatum)糖蛋白的抗肿瘤作用，结果表明，脱皮松藻糖蛋白可以通过诱导人乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡降低肿瘤细胞活力，其半抑制质量浓度为55 μg/mL。Tabarsa等[17]则探索了刺松藻糖蛋白与免疫调节活性间的关系，结果表明，糖蛋白缺少蛋白部分则不能刺激RAW264.7细胞释放NO，同样单一的蛋白组分也不能对RAW264.7细胞产生显著的刺激作用，这证明松藻硫酸化蛋白质的这种特殊空间构型能对其免疫调节活性产生决定性作用。

松藻中存在的甾醇类物质也是一种具有良好生物功能的物质。Kim等[18]研究发现，刺松藻中的赤桐甾醇可以通过诱导黑色素瘤A2058的凋亡发挥抗肿瘤功效，其半抑制浓度仅为150 μmol/L。Ali等[55]在对松藻中具有抗菌活性物质筛选时发现，松藻(C.iyengarii)中的类固醇类物质以及两种甾体苷均具有一定的抗菌活性，特别是甾体苷iyengaroside-A和甾醇半乳糖苷的抗菌效果最佳，对大肠杆菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia)、白喉杆菌(Corynebacteriumdiptheriae)、痢疾志贺菌(Snigelladysentri)等均有抑制作用，且效果优于抗菌药物四环素。Lee等[56]的体内和体外试验表明，刺松藻中提取的甾醇类物质对紫外线诱导的促炎反应和氧化反应均具有抑制作用，能够减少促炎蛋白如COX-2、iNOS、TNF-α等的表达，有效抑制促炎中介物PGE2、NO的产生，同时还可以抑制脂质过氧化、蛋白质羰基化。

另外，对松藻藻管黄素、纤溶酶的生物活性也有报道。Ganesan等[57]对刺松藻管藻黄素抗血管生成的研究中发现，其能显著抑制人脐静脉细胞增殖，在10 μmol/L时对人脐静脉细胞抑制率高达44%，浓度为25 μmol/L时无血管生成。此外，Choi等[19]指出，刺松藻中的纤溶酶能够延长活化部分凝血活酶时间和血浆凝血酶原时间，并且血小板功能分析结果表明，纤溶酶还可以延长凝血时间，具有很好的溶栓、抗凝血、抗血小板生成活性。殷帅文等[58]对刺松藻提取物的抑菌活性研究发现，刺松藻提取物对枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)有一定的抑制活性(质量浓度6 mg/mL时，抑菌圈直径为11 mm)，经鉴定这种抑菌活性物质为植醇乙酸酯。

综上可知，松藻多糖的生物活性研究虽然是现阶段的主要研究方向，但对其活性的探索尚不够深入，对其抗氧化、抗炎症、免疫调节等生物活性的探索仍处于初级阶段。同时，对松藻中其他活性成分(蛋白、甾醇、管藻黄素等)提取工艺、结构解析、生物活性研究鲜有报道，这将成为未来松藻生物活性物质研究的重点方向之一。

3 松藻的应用潜力

作为富含多种生物活性物质的绿藻，松藻具有较大的生物医学和日用化工应用潜力。Griffin等[59]将刺松藻凝集素与胶体金耦合成凝集素—金结合物，绑定到人A1型血红细胞膜后，该复合物可以增强细胞在透射电子显微镜下观察效果，因此可应用于动物细胞组织的表面形态研究。另外，松藻还具有很强的金属吸附能力，Kannan等[60]利用这一特点开发出松藻(C.capitatum)水提物合成银纳米颗粒，合成物中银的含量可达63.7%，该银纳米颗粒具有抗菌、抗病毒活性，可用于非标记比色法检测酶促反应、抗菌水过滤器、金属催化、生物感应器等，具有安全、无毒、绿色环保等特点。张全斌等[61]根据松藻多糖对经典途径和旁路途径补体活性均具有显著的抑制作用，能够抑制补体系统的过度激活的特点，制备了一种松藻多糖抗补体药物，该药物对于由补体系统过度激活而导致的统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、急性呼吸窘迫综合征等多种疾病具有较好的预防和治疗效果。France[62]则研发出一种治疗女性停经前以及更年期的皮肤潮热或热闪光病症的外敷药物，该药物主要成分为刺松藻提取物，可应用于易受刺激的脸部和人体上部。Morishima等[63]根据海藻多糖的抗炎作用，将海藻多糖裂解产物(含刺松藻多糖)添加至牙膏中，制备出用于治疗牙周疾病的牙膏，并已投向市场。此外，刘德海等[64]公布了一种含有软毛松藻提取物的防晒化妆品，该化妆品不仅能有效降低有机防晒剂给人体带来的刺激和过敏反应，还能在防晒同时修复损伤皮肤，为皮肤补充水分。

松藻也可应用于农业、水产、食品工业。据联合国粮食及农业组织统计，每年全球海藻产量数千万吨，其中有很大一部分用于农业及园艺的生物肥料[65]。由于海藻提取物富含氮、镁、钾等植物生长所必需的微量元素以及植物生长激素、细胞分裂素、脱落酸、乙烯、多胺和甜菜碱等成分[66-67]，可促进种子发芽、幼苗生长，提高植物的环境耐受力[68]。因此，海藻提取物具有应用于生物肥料的潜力。Eldin等[69]将软毛松藻和马尾藻水提物混合液作用于小麦种子，研究证明，小麦种子经含量为20%的水提物混合液作用后，其发芽率高达98%，并且与空白对照组相比，麦芽长度、根部长度及种子的湿质量和干质量均显著增加。此外，松藻还可用于赤潮的预防、控制和减缓，赤潮对近海水域生态环境和沿海水产业的可持续发展造成了极大的威胁，传统上利用化学药物杀灭赤潮生物，不利于经济效益和环境保护[70]，浦寅芳等[71]对刺松藻甲醇提取物的抑藻活性检测结果表明，当质量浓度为4.0 mg/mL时，刺松藻甲醇提取物可以明显抑制有毒赤潮藻类米氏凯伦藻(Kareniamikimotoi)的生长，抑制率可达76.5%。在水产养殖领域，松藻则可作为重要的天然饵料，潘忠正等[72]指出，刺松藻作为鲍的天然饵料，鲍壳日增长97 μm，高于裙带菜和皱海带为饵料的鲍，因此以刺松藻为饵料不仅解决了水产品养殖业在夏、秋季缺少优质饵料的困难，也缩短了鲍的养殖周期，同时这也为解决松藻藻华提供新的思路。随着对松藻研究的不断深入，松藻还可应用于食品工业，Ana等[73]将软毛松藻和虫状松藻提取物作为可食用膜的成分用于微加工食品的保鲜，发现涂膜后的微加工食品可在(4±2) ℃条件贮存20 d，有效维持食品的品质，无酶促褐变引起的组织变软或表面褐变。

4 松藻属藻类开发利用价值展望

松藻繁殖力强、营养丰富，是具有开发潜力的绿藻，然而我国对松藻资源及其生物活性物质开发利用程度尚处于初级阶段。目前，日本、韩国等国家已将松藻作为食品、化妆品的重要原料开发出多种上市产品，我国对松藻产品的开发利用却鲜有报道。另外，松藻因其广泛的环境适应力和快速的繁殖力，已成为威胁各国近海生态系统平衡的关键因素之一。面对日趋严重的能源及粮食危机，将松藻应用于农业、水产养殖业及食品加工业，是松藻资源综合利用的最佳选择。同时，应进一步加强对松藻多糖、蛋白质、甾醇等生物活性探索，特别是分离纯化后单一组分功能性结构解析、构效关系及活性作用机制研究，以期开发出治疗效果好、副作用低的天然活性物质医药保健产品。