张峰峰，周 可，谢凤行，赵 琼，孙海波，赵玉洁

( 天津市农业生物技术研究中心，天津 300192 )

近年来，我国水产养殖业发展迅速，集约化高密度养殖带来的养殖水体污染问题逐渐增多，不仅影响水产品的产量和品质，还会影响水体生态环境。其中氨氮污染已成为主要的污染源，通过具有硝化作用的微生物——硝化细菌去除氨氮污染成为最便捷高效的脱氮途径[1-3]。硝化细菌分为自养硝化菌和异养硝化菌，其中自养硝化菌因其自身不易繁殖、生物密度低、难以形成优势菌、脱氮效果较差等特点难以推广使用[4-5]。自Quastel等[6]首次分离出异养硝化菌株以来，越来越多的异养硝化细菌因其易于繁殖、适应性强、脱氮效率高等优点被广泛关注[7-11]。异养硝化菌应用的关键是其硝化能力，刘天琪等[12]发现一株具异养硝化功能的假单胞菌(Pseudomonassp.)，在氨氮初始质量浓度为300 mg/L时，其84 h对氨氮的去除率超过75%；邹艳艳等[13]发现一株根瘤菌(Rhizobiumsp.)，在氨氮初始质量浓度100 mg/L的条件下，其48 h对氨氮的去除率超过90%；孙庆花等[14]自海洋中筛得一株假单胞菌，对氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮等混合氮源的去除率超过90%。

综合目前的研究成果，大多数异养硝化菌在处理高含量氨氮废水(氨氮质量浓度>100 mg/L)时，脱氮不彻底，有大量氨氮残留。笔者自天津市西青区养殖池活性污泥中分离筛选出一株去除氨氮能力较强的菌株AD-28，对其进行了生理生化鉴定和16S rDNA同源性分析，鉴定其为嗜碱假单胞菌(P.alcaliphila)，并在实验室条件下分析不同环境因子和条件对该菌生长和氨氮去除特性的影响，以期为该菌株在养殖水体中的生物脱氮应用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源

取天津市各个郊区县养殖池中的水样和活性污泥，经过分离、筛选、鉴定后，确定一株去除氨氮能力较强的菌株——嗜碱假单胞菌AD-28，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.8991。

1.1.2 培养基

DM液体培养基：柠檬酸钠5 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，(NH4)2SO41 g，蒸馏水1 L，pH 7.2。

1.2 方法

以DM液体培养基为基础，试验容器为250 mL锥形瓶，每瓶装培养基100 mL，于高压灭菌锅121 ℃灭菌20 min，接种量为1%。培养24 h后测定吸光度(OD600 nm)和氨氮含量。

基础培养条件：碳源为柠檬酸钠，碳氮比为20，温度30 ℃，pH 7.0，转速150 r/min，盐度为0，初始氨氮质量浓度为20 mg/L(硫酸铵为氮源)。

单因素试验测定的影响因子包括碳源、碳氮比、温度、pH、转速、盐度、初始氨氮质量浓度7项，分别替换基础培养条件下对应的影响因子，试验设计如下：

碳源：以丁二酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、葡萄糖、酒石酸钾钠、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉为碳源，对照组不加碳源，共9个处理。

碳氮比：通过调节柠檬酸钠含量来改变液体培养基碳氮比，共设置10、15、20、30、40共5个处理；

温度：10、15、20、25、30、35 ℃，共设置6个处理，接种培养后24、48 h测定OD600 nm和氨氮含量。

pH：4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，共设置7个处理。

转速：设定0、60、90、120、150、180 r/min，共设置6个处理。

盐度：NaCl按0、10、20、30、40、50 g/L，共设置6个处理。

初始氨氮质量浓度：设置20、40、80、120、160、200、400、800、1600、2000、3000 mg/L，共11个处理。

1.3 测定方法

菌体生长吸光度(OD600 nm)采用岛津UV-2550型紫外可见分光光度计在光波长为600 nm处测定。氨氮质量浓度的测定采用纳氏试剂法。

1.4 数据分析

氨氮去除率(η1)计算公式为：

η1=(A0-At)/A0×100%

式中，A0、At分别为处理前、后的氨氮质量浓度(mg/L)。

试验结果用平均值±标准差表示，运用软件SPSS 15.0，经单因素方差分析及Duncan′s多重比较检验试验结果的差异显著性，P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 碳源对嗜碱假单胞菌AD-28氨氮去除能力的影响

将嗜碱假单胞菌AD-28接入不同碳源的异养硝化培养基，24 h后测定OD600 nm和氨氮去除率。以硫酸铵为底物氮源，嗜碱假单胞菌AD-28对8种不同碳源的利用程度有较大差异。嗜碱假单胞菌AD-28以柠檬酸钠、丁二酸钠、乙酸钠作为碳源时，OD600 nm值较高，生物量较高，24 h氨氮去除率均超过90%，为最佳碳源；而以葡萄糖为碳源时，由于受到培养基自身颜色的影响，虽然菌液OD600 nm值较高，但菌株数量并不多，因此其氨氮去除率也较低，仅为13.35%；嗜碱假单胞菌AD-28对其他碳源利用效果一般，其OD600 nm值和氨氮去除率均显著低于最佳的3种碳源(P<0.05)(图1)。

图1 碳源对嗜碱假单胞菌AD-28生长及氨氮去除率的影响

2.2 碳氮比对嗜碱假单胞菌AD-28氨氮去除能力的影响

24 h测定不同碳氮比对嗜碱假单胞菌AD-28的影响，发现在碳氮比为10、15、20、30、40 5个水平上，其OD600 nm值先升后降，且不同处理之间差异显著，碳氮比为20时，OD600 nm值显著高于其他处理(P<0.05)，说明碳氮比对菌株生物量影响较大。其氨氮去除率在碳氮比为15～40的条件下去除率较高，达到93%以上，且各处理间无显著差异(P>0.05)，而在碳氮比为10的条件下，其氨氮去除率仅为87.47%(图2)。可能是碳氮比较低时，抑制了菌株对氨氮的去除，而碳源增加到一定程度，又对氨氮的去除影响较小。最后确定碳氮比为20是嗜碱假单胞菌AD-28生长和脱氮的最佳碳氮比。

图2 碳氮比对嗜碱假单胞菌AD-28生长及氨氮去除的影响

2.3 温度对嗜碱假单胞菌AD-28氨氮去除能力的影响

温度是影响微生物生长和生存的重要因素之一。当温度适宜时，微生物生长快，相关活性和代谢产物达到较高水平。培养温度在25～35 ℃时，接种后24 h菌株生长量即达到最高，显著优于其他低温处理(P<0.05)(图3a)，其氨氮去除率也超过90%(图3b)，说明有利于该菌株生长和去除氨氮的最适温度为25～35 ℃。而温度为20 ℃时，接种后24 h菌株生长量显著低于最适温度(P<0.05)，但是其氨氮去除率仍超过88%，至48 h其生物量和氨氮去除率与最适温度处理无显著差异(P>0.05)。而在温度为15 ℃时，接种后24 h菌株生长量和氨氮去除率均较低，但在48 h其生物量和氨氮去除率与最适温度处理无显著差异(P>0.05)。10 ℃时，嗜碱假单胞菌AD-28几乎不生长，氨氮也未去除。综上，嗜碱假单胞菌AD-28生长和去除氨氮的最适温度为25～35 ℃，而15～20 ℃会延迟菌株的生长，降低其对氨氮的去除效率，但不会影响其最终的去除效果，由此可知，嗜碱假单胞菌AD-28可以作为低温脱氮的备选菌株，10 ℃则严重抑制菌株的生长和脱氮。

图3 温度对嗜碱假单胞菌AD-28生长及氨氮去除率的影响

2.4 pH对嗜碱假单胞菌AD-28氨氮去除能力的影响

接种24 h后发现，不同pH对嗜碱假单胞菌AD-28菌株的去除氨氮能力影响显著(图4)。当pH为4.0～5.0时，嗜碱假单胞菌AD-28并未明显生长，其氨氮也未明显降解，说明较低的pH对其生长具有较大的抑制作用。pH为6.0时，嗜碱假单胞菌AD-28的OD600 nm值较高，说明其生物量较大，氨氮去除率达96.26%以上，pH为7.0～10.0时，菌液的OD600 nm值低于pH为6.0的OD600 nm值，但对氨氮的去除率仍能达96%以上。说明嗜碱假单胞菌AD-28适宜在中性偏碱的条件下生长，在偏碱性的环境下硝化活性优于酸性环境。其主要原因为，pH直接影响酶的活性，环境中的氢离子浓度如果超过了微生物酶的适应范围，微生物对营养物质的吸收和酶的活力均会相应受到影响。

图4 pH对嗜碱假单胞菌AD-28生长及氨氮去除率的影响

2.5 转速对嗜碱假单胞菌AD-28氨氮去除能力的影响

溶解氧是细菌生长的关键因素，在不同转速下，培养液含有不同的溶解氧，对嗜碱假单胞菌AD-28的生长和代谢产生影响，从而影响其硝化效率。随着转速的增大，OD600 nm值出现先增后减的趋势，在转速为120 r/min时OD600 nm值达到最高，说明此转速最利于菌株的生长；在转速为60～180 r/min 时，菌株的氨氮去除率也较高，24 h基本被完全去除；在0 r/min时，24 h其OD600 nm值虽低于其他转速的OD600 nm值，但差异不显著(P>0.05)，其氨氮去除率也较高，但显著低于其他转速的OD600 nm值(P<0.05)(图5)。曾庆梅等[15]研究发现，摇床转速越高，培养基中溶解氧含量越高，其值可由静止时的0.2 mg/L升至250 r/min时的4.2 mg/L，溶解氧含量越高越利于菌株HN-S的硝化脱氮。但肖继波等[9]研究却发现，菌株DN7对溶解氧含量并不敏感，反应3 d后，脱氮率变化较小，但超过90%。

2.6 盐度对嗜碱假单胞菌AD-28氨氮去除能力的影响

随着NaCl质量浓度的增加，嗜碱假单胞菌AD-28的OD600 nm值先升后降，NaCl质量浓度为30 g/L时OD600 nm值最高，说明此NaCl有利于菌株的生长；NaCl质量浓度为10～40 g/L时，其氨氮去除率较高，24 h的氨氮去除率超过99%；NaCl质量浓度为50 g/L时，其氨氮去除率也达到了84.16%(图6)。嗜碱假单胞菌AD-28具有较好的耐盐性，在NaCl质量浓度下也可以正常生长，且具有相对较高的氨氮去除能力，在以后的实际应用中可用于海水养殖池中。

图5 转速对嗜碱假单胞菌AD-28生长及氨氮去除率的影响

图6 盐度对嗜碱假单胞菌AD-28生长及氨氮去除率的影响

2.7 氨氮质量浓度对嗜碱假单胞菌AD-28脱氮能力的影响

在前期筛选出的适宜菌株生长和去除氨氮的最佳条件下，测定嗜碱假单胞菌AD-28对不同质量浓度氨氮的去除能力。氨氮初始质量浓度为20～160 mg/L时，随着质量浓度的增加，菌株的OD600 nm值逐渐增加，说明低质量浓度的氨氮为菌株的生长提供了氮源，促进了菌株生物量的增加，且培养24 h后各处理的氨氮去除率均超过95%，说明在氨氮初始质量浓度为20～160 mg/L时，嗜碱假单胞菌AD-28对氨氮的去除率不受初始氨氮质量浓度的影响，24 h对氨氮的去除率均较高；当氨氮初始质量浓度为200 mg/L时，嗜碱假单胞菌AD-28 24 h的氨氮去除率达86.6%；氨氮初始质量浓度为400～3000 mg/L时，嗜碱假单胞菌AD-28的OD600 nm值无显著差异(P>0.05)，但其氨氮的去除率逐渐降低，说明初始氨氮质量浓度过高，嗜碱假单胞菌AD-28生物量达到最大时就不再利用氨氮，所以对高质量浓度氨氮的去除率也较低。

3 讨 论

3.1 异养硝化菌的种类和脱氮能力分析

异养硝化菌主要分为：气单胞菌属(Aeromonas)[7]、芽孢杆菌属(Bacillus)[13]、脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)[16]、粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)[17-19]、假单胞菌属[12,14,20]、节杆菌属(Arthrobacter)[21]、红球菌(Rhodococcussp.)[22]、

图7 氨氮质量浓度对嗜碱假单胞菌AD-28生长及氨氮去除率的影响

不动杆菌属(Acinetobacter)[23]等,Anoxybacilluscontaminans[24]、Zobellellataiwanensis[25]等新的脱氮菌株也被发现。而嗜碱假单胞菌仅曾被应用于重金属废水处理[26]，未见其脱氮应用的研究报道。

硝化细菌在生态系统中转化氨氮的独特功能使其难以为其他生物所替代。本试验中嗜碱假单胞菌AD-28具有较强的硝化作用，在氨氮初始质量浓度为160 mg/L的条件下，24 h的氨氮去除率超过98%，高于相似条件下气单胞菌的氨氮去除率(77.71%)[7]。曾庆梅等[15]筛选出的产碱杆菌属菌株ES-SDK-3，处理氨氮初始质量浓度为182.30 mg/L的废水，30 h后氨氮去除率为99.8%，与本试验中菌株的硝化性能相似。说明该菌株具有高效的去除氨氮效果，有较大的应用价值。

3.2 不同环境因子对异养硝化菌脱氮能力的影响

异养硝化菌在代谢底物时，以NH4+作电子供体，利用外加碳源提供的化学能，通过氨氮加氧酶将氨转化为羟胺，再经羟胺氧化酶转化为亚硝酸盐或一氧化二氮[27]。碳源不仅影响异养硝化菌的生长，也影响其硝化活性[28]。邹艳艳等[13]分离的异养硝化—好氧反硝化菌株ZB612最适碳源为葡萄糖；孙庆花[14]等分离的海洋菌株y3的最适碳源为柠檬酸钠；王田野[29]等分离的一株异养硝化好氧反硝化菌SQ2最适碳源为琥珀酸钠。菌株的种类不同，适于菌株生长的最适碳源也不同，而嗜碱假单胞菌AD-28最适碳源种类较多，对柠檬酸钠、丁二酸钠、乙酸钠的吸收利用均最好，决定其在以后的实际应用中使用范围更广。碳源量对菌体生长和硝化效率起着重要的作用，若碳源不足，则无足够的电子流来提供足够的能源以供菌体生长，硝化效率也会变低；但当提供的碳源远高于菌体的需求，此时碳源已非限制性因素，菌体的生长和代谢活性处于稳定阶段，脱氮效率也增加较少，本研究发现，碳氮比为20时最易于嗜碱假单胞菌AD-28的生长和脱氮。

温度能改变酶的活性。温度过低，酶的活性受到抑制；温度过高则会导致酶失活。耐低温异养硝化菌A.arilaitensis[21]和假单胞菌GL19[30]最低耐受温度均为15 ℃。本研究中，嗜碱假单胞菌AD-28生长和去除氨氮的最适温度为25～35 ℃，10 ℃时严重抑制菌株的生长和脱氮，15～20 ℃会延迟菌株的生长，降低其对氨氮的去除效率，但不会影响其最终的去除效果，因此，嗜碱假单胞菌AD-28可以为低温脱氮的备选菌株。相对于自养硝化菌，异养硝化菌所能耐受的pH范围更宽。嗜碱假单胞菌AD-28在pH为6.0～10.0均能生长和进行硝化反应，对氨氮的24 h去除率均超过96%，在pH为6.0时其生物量最大。摇床转速影响了菌株生长培养液的溶解氧含量，随着摇床转速的升高，溶解氧含量不断增加，在转速为120 r/min时生物量达到最高，转速为60～180 r/min时，其24 h氨氮去除率均能超过90%，优于0 r/min，说明较高的溶解氧含量有利于硝化反应的进行，低溶解氧条件抑制了菌株的硝化反应。

由于天津水体高盐度以及海水养殖的特殊性，对嗜碱假单胞菌AD-28的耐盐性进行了测定，结果发现，NaCl质量浓度为10～40 g/L时，其氨氮去除率较高，24 h均能超过99%，而NaCl质量浓度为50 g/L时，其氨氮去除率也达到84.16%。说明嗜碱假单胞菌AD-28具有较强的耐盐性，在高盐胁迫下，其硝化反应也较强。

3.3 底物质量浓度对异养硝化菌脱氮能力的影响

一定数量的微生物对氨氮的脱除量是有限的，当氨氮质量浓度超出其所能脱除的最大范围时，微生物就不能再脱除多余的氨氮，同时氨氮质量浓度过高，菌株的活性会受到高质量浓度氨氮的抑制，影响其正常的生长繁殖，进而影响其脱氨能力。本研究中设计不同的初始氨氮质量浓度，发现初始氨氮质量浓度为20～160 mg/L时，随质量浓度的增加生物量逐渐增多，且培养24 h后氨氮的去除率均超过95%，而氨氮初始质量浓度为200 mg/L时，其24 h氨氮去除率也达到86.6%，氨氮初始质量浓度为400～3000 mg/L时，生物量无显著差异，但氨氮的去除率逐渐降低，且显著低于其他低质量浓度的处理结果。

4 结 论

本试验中对影响嗜碱假单胞菌AD-28生长和氨氮去除效果的因素，包括碳源、碳氮比、温度、pH、转速、初始氮质量浓度及盐度进行了考察。发现适于嗜碱假单胞菌AD-28生长和氨氮去除的最佳条件为：碳源为柠檬酸钠、丁二酸钠、乙酸钠，碳氮比为20，温度为25～35 ℃，pH为6.0，转速为120 r/min，对初始质量浓度为20～160 mg/L的氨氮去除率超过95%。嗜碱假单胞菌AD-28具有一定的耐低温性能，在15 ℃可以生长，且氨氮去除率在48 h达到91%；具有较强的耐盐性，可以在NaCl质量浓度为50 g/L的条件下生长，且24 h氨氮去除率可达84.16%；嗜碱假单胞菌AD-28耐低温和耐盐的特性为以后在低温或海水中的应用提供了可能。