王 凯，于永翔,2，张 正,2,3，王印庚,2,3，廖梅杰,2,3

( 1.中国水产科学研究院 黄海水产研究所，山东 青岛 266071； 2.青岛海洋科学与技术国家实验室, 海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，山东 青岛 266071； 3.农业农村部海水养殖病害防治重点实验室，山东 青岛 266071 )

大规模病害的频繁发生，给水产养殖业造成了严重的经济损失[1]，成为制约产业发展的主要问题之一。这其中，以细菌为病原的疾病更为常见。水产动物的细菌性疾病普遍具有传染快、死亡率高等显著特点，往往成为决定养殖成活率的关键性因素之一。目前，水产养殖细菌性病害防治手段主要包括传统化学药物、渔用疫苗、微生态制剂和中草药等。相比于疫苗和微生态制剂，药物的使用在我国现阶段的养殖生产中更为常见。传统化学药物包括抗生素和消毒剂，在疾病防控中起效快、效果直接，但也伴随着环境污染[2]和耐药基因迁移与整合等[3]诸多问题，因此受到越来越严格的管控。在西方发达国家，对于水产疾病的防控多以疫苗为主[4]。虽然我国渔用疫苗的研究起步于20世纪70年代，但迄今为止也仅有4个疫苗获得国家新兽药证书，其中只有草鱼出血病灭活疫苗被列入国家兽药标准。我国微生态制剂的研究始于1979年，迄今也只有蛭弧菌(Bdellovibrio)微生态制剂为国家级二类新兽用微生物生态制品，同时也是我国唯一获得国家批准的二类兽用微生物制剂。因此，我国水产疫苗和微生态制剂的应用[5]在现阶段依然受到各种因素的限制，面对种类多样的细菌性病原，水产养殖产业中对于疾病防控更多的还是依靠药物。

与抗生素等化学药物相比，中草药具有产物天然、安全无污染、不易产生耐药性等优势，特别是其中的某些成分还兼具免疫增强效果，可以提高动物机体免疫能力[6-7]。但中草药大多成分复杂，特别是在水环境条件下更难以进行深入的药理和药效研究，因此中草药单体成为水产动物疾病防控研究的主要方向之一。

黄连素又称小檗碱，属异哇琳生物碱，天然品主要存在于小檗科、罂粟科、毛莨科、芸香科等植物中[8]，具有抗炎、抗癌、抑菌、降脂、降糖等广泛的药理作用[9]。本研究以黄连素为主要研究对象，选取10种水产动物常见的病原菌，进行黄连素的体外抑菌和杀菌剂量测定。同时，以美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacteriumdamselaessp.damselae)为指示菌，进行黄连素的药效稳定性研究。美人鱼发光杆菌美人鱼亚种分离自山东省长岛县大型深水网箱养殖的患病许氏平鲉(Sebastesschlegeli)病灶，该菌通过人工感染试验证实对许氏平鲉具有极强的致病性，且其分离环境无过往用药史，适宜作为药效研究的指示菌。研究结果旨在为黄连素乃至中草药在水产疾病防控上的规范应用提供借鉴与参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用菌种中迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)[10]、鳗弧菌(Vibrioanguillarum)[11]、鲨鱼弧菌(V.carchariae)[12]分离自患出血病的褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)，溶藻弧菌(V.alginolyticus)和大菱鲆弧菌(V.scophthalmi)[13]分离自患病大菱鲆(Scophthalmusmaximus)，哈维氏弧菌(V.harveyi)[14]、假交替单胞菌(Pseudoalteromonasnigrifaciens)[15]分离自保苗期仿刺参(Apostichopusjaponicus)，美人鱼发光杆菌美人鱼亚种、轮虫弧菌(V.rotiferianus)分离自患病许氏平鲉，副溶血弧菌(V.parahemolyticus)[16]分离自患化板症的仿刺参。以上菌种均由中国水产科学研究院黄海水产研究所实验室保存，并已验证其致病性。

试验用黄连素标准品(纯度≥98%)购于索莱宝科技有限公司。

1.2 菌种培养与菌液制备

将超低温保存的试验菌株于MH琼脂培养基上28 ℃划线培养24 h，挑选纯菌落转接3次后，再挑取单菌落接种到灭菌MH肉汤培养基中，制作菌悬液母液，分光光度法调节菌液密度至1.0×107cfu/mL。

1.3 最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度测定

参考文献[17]中的二倍稀释法做适当改进，用无菌生理盐水将黄连素稀释成质量浓度为1600 mg /L 的母液。取10支灭菌试管，1号试管加入3.6 mL MH液体培养基和6.4 mL黄连素母液混匀，2～8号试管加入5 mL MH液体培养基，以二倍稀释法进行倍比稀释，最终使各管黄连素质量浓度为1024、512、256、128、64、32、16、8 mg/L，9号试管加5 mL黄连素母液做阴性对照，10号试管加5 mL MH液体培养基作阳性对照。除9号试管外，其余每管加入0.1 mL 菌悬液，轻轻晃动混匀。在28 ℃、180 r/min下培养16～18 h，观察试管中培养结果。结果判定，试管内液体呈现浑浊即为有菌生长，清澈透明则为无菌生长，以无菌生长的最低稀释度确定为最小抑菌质量浓度值。每个质量浓度设3个平行。在最小抑菌质量浓度测定的基础上，从无混浊试管开始向上2个稀释度共3 个试管中各吸取0.1 mL 样液，接种至MH琼脂培养基，28 ℃培养16～18 h后观察，平板菌落不超过5个的相应试管中的药物质量浓度即为该种药物对供试菌株的最小杀菌质量浓度。

1.4 黄连素稳定性初步研究

1.4.1 不同温度处理对黄连素杀菌效果的影响

选取美人鱼发光杆菌美人鱼亚种为指示菌，菌液密度调节至1.0×107cfu/mL。参考指示菌的最小杀菌质量浓度，用无菌纯水配制相同质量浓度的黄连素溶液，分别置于4、20、40、60、80、100、121 ℃温度下处理30 min，待恢复至室温后，分别取试管按5 mL黄连素溶液+5 mL MH液体培养基+100 μL菌液配置体系(此时体系中黄连素质量浓度为最小杀菌质量浓度)，对照组体系为5 mL黄连素溶液+5 mL MH液体培养基+100 μL菌液(黄连素为室温处理)，混匀后28 ℃、180 r/min培养，20 min后吸取0.1 mL涂布胰蛋白胨大豆肉汤琼脂平板，计算残留的细菌数量，并按下式计算不同温度处理下黄连素的杀菌率，试验设3次重复。

100%

1.4.2 不同贮存时间对黄连素杀菌效果的影响

将上述20、60、100 ℃处理的黄连素溶液于室温下避光存储，于第1、7、14、28、35 d后计算杀菌率，比较不同温度处理和不同时间存储后黄连素的药效稳定性。

1.4.3 不同Na+、Ca2+、K+、Mg2+质量浓度对黄连素杀菌效果的影响

根据海水的盐度配比，分别设置NaCl的质量浓度梯度为0、5、10、15、20、25 mg/L，CaCl2、KCl、MgCl2的质量浓度梯度为0、1、2、3、4、5 mg/L。以对应盐溶液配置质量浓度为2倍最小杀菌质量浓度的黄连素溶液，对照组不加黄连素，计算杀菌率，分析不同金属离子质量浓度下黄连素的杀菌效果。

1.4.4 数据处理

运用Excel 2016和SPSS 19.0试验数据进行处理，杀菌率相关数据均用平均值±标准差表示。

1.5 安全性试验

药物安全性试验以人工繁育的许氏平鲉为参考物种，以药浴方式进行。试验鱼购自威海某育苗场，体质量(37.1±5.0) g。取健康许氏平鲉40尾，禁食1 d后，分为3个试验组和1个对照组，每组设置2个平行，即每个平行5尾鱼。试验于50 L水槽中进行，根据测定的黄连素对指示菌的最小杀菌质量浓度，设定3个试验组黄连素质量浓度分别为50%、1倍和2倍最小杀菌质量浓度值，对照组不做处理。试验全程不换水，正常充气，12 h后对照组和试验组各投喂10 g颗粒饵料，观察试验组和对照组的活力及摄食状况，并于24 h后再次观察鱼的活力及死亡率。

2 结 果

2.1 黄连素对10种水产细菌性病原的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度

测定黄连素对10种水产病原菌的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度，试验结果见表1、图1。由表1、图1可见，黄连素对10种病原菌的最小抑菌质量浓度为64～256 mg/L。其中，黄连素对大菱鲆弧菌和溶藻弧菌抑菌作用最明显，最小抑菌质量浓度为64 mg/L；对鳗弧菌、迟缓爱德华氏菌、美人鱼发光杆菌、鲨鱼弧菌、假交替单胞菌和轮虫弧菌的抑菌作用次之，最小抑菌质量浓度为128 mg/L；对哈维弧菌和副溶血弧菌抑菌作用较弱，最小抑菌质量浓度为256 mg/L。黄连素对10种病原菌的最小杀菌质量浓度为256～1024 mg/L。其中，对鳗弧菌、大菱鲆弧菌、迟缓爱德华氏菌、溶藻弧菌、鲨鱼弧菌和轮虫弧菌杀菌作用最强，最小杀菌质量浓度为256 mg/L；对美人鱼发光杆菌、副溶血弧菌和假交替单胞菌的杀菌作用次之，最小杀菌质量浓度为512 mg/L；对哈维氏弧菌杀菌作用较弱，最小杀菌质量浓度为1024 mg/L。

2.2 温度和储存时间对黄连素杀菌效果的影响

以美人鱼发光杆菌美人鱼亚种为指示菌，测定不同温度及时间处理下黄连素对指示菌的杀菌对数值，试验结果见表2、表3。结果表明，512 mg/L的黄连素溶液在4～121 ℃条件下处理30 min，对指示菌的杀菌率均超过99%，且无明显差异。试验结果表明，黄连素的抑菌效果不受温度的影响；20、60 ℃及100 ℃处理的黄连素分别于室温存放1、7、14、28、35 d后，对指示菌的杀菌率依然均超过99%，表明存放时间对黄连素的杀菌效果无明显影响。

表1 黄连素对10种水产病原菌的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度 mg/L

图1 黄连素对10种病原菌的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度1.鳗弧菌；2.哈维弧菌；3.大菱鲆弧菌；4.迟缓爱德华氏菌；5.美人鱼发光杆菌；6.副溶血弧菌；7.溶藻弧菌； 8.鲨鱼弧菌；9.假交替单胞菌；10.轮虫弧菌.

温度/℃420406080100121杀菌率99.21±0.0299.32±0.0499.34±0.199.57±0.0799.55±0.0599.53±0.1199.48±0.07

表3 存放时间对黄连素杀菌率的影响 %

2.4 不同Na+、Mg2+、Ca2+、K+质量浓度对黄连素杀菌效果影响

分别用质量浓度为0、5、10、15、20、25 mg/L的NaCl盐溶液配置512 mg/L的黄连素溶液，作用30 min后，杀菌率均超过99%，质量浓度为0、1、2、3、4、5 mg/L的MgCl2、CaCl2、KCl的盐溶液配置同等质量浓度的黄连素溶液，作用30 min后杀菌率也均超过99%(图2)。结果表明，Na+、Mg2+、Ca2+、K+等离子对黄连素的杀菌效果无显著影响。

图2 不同金属离子质量浓度对黄连素杀菌效果的影响

2.5 黄连素安全性试验结果

试验组和对照组许氏平鲉12 h后均无死亡，投喂饵料后50%最小杀菌质量浓度和最小杀菌质量浓度试验组摄食情况与对照组无显著差异，摄食完成后均无残饵，而2 倍最小杀菌质量浓度试验组则有少量残饵。试验24 h后，各试验组与对照组均无死亡，试验鱼活力正常(表4)。

表4 黄连素对许氏平鲉的安全性试验

3 讨 论

3.1 中草药杀菌效果研究

疾病的普遍发生给水产养殖生产带来严重的压力，抗生素和化学药物的频繁使用也不断诱导水产病原菌耐药性的产生，增加了对疾病的防治难度。而中草药源远流长，并经历了数千年的筛选和应用，长时间的人类临床应用经验和无数的动物试验研究对中草药的有效性均做出了肯定[18]，近年来中草药在抑菌杀菌方面的效果也得到证实[19]。阿琪玛等[20]研究了金银花、黄连、何首乌、地榆、五味子、穿心莲、虎杖等16种中草药对牛源致病性大肠杆菌(Escherichiacoli)的体外抑菌效果，结果表明，金银花和黄连对大肠杆菌O1体外抑菌效果最好，五味子对大肠杆菌O8体外抑菌效果最好，而虎杖的体外抑菌效果最差。梁利国等[21]采用琼脂扩散法测定了五倍子等18种中草药对鳗弧菌、副溶血弧菌、河口弧菌(V.aestuarianus)及霍乱弧菌(V.cholerae)等4种病原弧菌的抑制作用，五倍子、苏木、地锦草、石榴皮、黄芩、虎杖和山楂7种中草药对病原弧菌具有较好的抑菌效果，而金银花等11种中草药抑菌作用较弱。但这些研究多集中在对中草药单方或复方研究，研究对象为多种药物成份的复合物，并未对起效成份的药效学和药理学进行深入细致的分析。

3.2 中药单体杀菌效果研究

与复方中药相比，中药单体成份明确，易于进行定性、定量[22]和开展药效学的研究。黄连素作为中药提取物，为苯丙异喹啉类季铵型生物碱，具有广谱抗菌作用，并已在动物医学和人类临床上应用多年[23-27]。谢丽铃等[28]研究表明，黄连素对副溶血弧菌、溶藻弧菌和嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)3种水产病原菌的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度分别为0.391 mg/mL和0.391 mg/mL、0.391 mg/mL和 0.781 mg/mL、0.781 mg/mL和1.563 mg/mL，且黄连素会严重破坏病原菌的菌体形态，使病原菌的迟缓期延长2～7 h。其中，对溶藻弧菌的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度均大于本试验研究结果(64 mg/L和256 mg/L)，这可能与试验所用黄连素药物的来源有关。本试验以纯品黄连素为对象，用最小二倍法对黄连素进行抑菌作用的初步测定。试验结果表明，黄连素对10种革兰氏阴性水产病原菌均具有较强的抑制和杀灭作用。经不同温度处理后的黄连素对目标仍具较强的杀菌效力，说明温度变化并不会影响黄连素的杀菌药效。而且经121 ℃热处理后的黄连素仍具有较好的杀菌效果。由此可知，黄连素适用于人工配合饲料的制配生产工艺，可以拌于饵料中进行不高于121 ℃的高温灭菌。药效稳定性的研究也表明，即使经不同温度处理后的黄连素溶液室温存放35 d后杀菌效果依然无明显变化，说明其结构性质比较稳定，可以耐受大多数储存条件。用不同离子质量浓度配制的黄连素溶液杀菌效果也无明显变化，初步表明，黄连素的使用不受水中Na+、Mg2+、Ca2+、K+等金属离子的影响，因此也适用于海水养殖环境。

试验结果表明，黄连素对主要海水养殖病原菌的杀菌效果较好，且药物特性非常稳定，适宜作为水产药物进行产业开发。同时，在研究过程中以许氏平鲉为试验对象，进行黄连素对海水鱼类的初步安全性检测，试验发现，虽然各质量浓度的黄连素长时间药浴并未造成许氏平鲉的死亡，但1024 mg/L的剂量已对许氏平鲉的摄食产生了相应的影响。长期以来，研究人员对黄连素及各种衍生物的安全性论证从未停止。赵锡艳等[29]详尽地从动物试验、临床研究及个案报道等方面论述了黄连单方及其主要成分对人和小鼠的不良反应，如便秘、腹泻、过敏等；何蕾等[30]从DNA层面报道了盐酸小檗碱对小鼠肝、脾、肾细胞DNA损伤的影响，盐酸小檗碱可引起肝、脾、肾DNA损伤，并呈显著的剂量—效应关系。以上研究均表明，黄连素的临床使用应严格控制剂量。而在水产动物的研究领域尚未见黄连素不良反应的报道。通过本次试验，也初步证实了黄连素可能对鱼类的摄食造成一些负面影响，而不同物种对黄连素的耐受情况必然会有差别，因此在考虑黄连素作为水产杀菌药物的同时，更应深入研究黄连素对不同水产动物的安全质量浓度范围，以期为黄连素在水产病害方面的应用提供更为精确的参考。