拟微绿球藻粉对大菱鲆幼鱼生理和脂肪酸组成的影响

2019-01-17胡冬雪王晓艳乔洪金王际英李宝山孙永智

水产科学 2019年1期

胡冬雪，马季，张燕，王晓艳，乔洪金，王际英，李宝山，孙永智

( 1.上海海洋大学，水产科学国家级实验教学示范中心，农业农村部鱼类营养与环境生态研究中心，水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心，上海 201306； 2.山东省海洋资源与环境研究院，山东省海洋生态修复重点实验室，山东烟台 264006 )

随着全球渔业捕捞量的减少和水产养殖业的大规模扩张，鱼油的价格快速上升，饲料成本也随之增加，寻找替代鱼油的新型饲料原料已是水产饲料行业亟需解决的问题之一。目前常用的替代原料有动物油脂和植物油，尤其是植物油，以其价格低廉和来源广泛被用作主要的鱼油替代原料[1]，在多种鱼类饲料中进行了鱼油替代研究[2-4]，而多数养殖鱼类特别是海水鱼类以高不饱和脂肪酸为必需营养素，因此植物油并非理想的鱼油替代原料，此外，植物油中还含有高水平的抗营养因子[5-7]，对于鱼类的营养也是不利的。

鱼体内的高不饱和脂肪酸主要经食物链传递，来源于微藻，拟微绿球藻(Nannochloropsis)的脂肪酸组成和鱼油类似，含有二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸等鱼类必需的n-3高不饱和脂肪酸[8]，且含有丰富的天然色素如玉米黄素和虾青素，可以增强免疫能力和抗氧化能力，提高鱼虾蟹苗种的发育和存活率[9-10]，同时又因为拟微绿球藻具有繁殖迅速、适温范围广、对pH适应性较强、易培养等特点，可利用电厂烟道气进行规模化培养，未来有作为饲料原料的潜力[11]。最近规模化生产的微藻已用于生物燃料和人体营养补充剂，持续研究有可能获得更广泛的市场和更低的成本[12-13]。前期研究表明，用微藻替代水产饲料中的鱼油，在适宜的替代水平范围内对水产动物无负面影响。Qiao等[14]研究发现，饲料中添加裂壶藻(Schizochytrium)、拟微绿球藻与大豆油的混合物替代褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)幼鱼饲料中的鱼油，对褐牙鲆幼鱼的饲料效率、生长性能和脂肪酸组成无显著影响；王庆超[15]研究发现，饲料中添加亚麻油和适量的裂壶藻替代大菱鲆(Scophthalmusmaximus)幼鱼饲料中的鱼油，可使鱼体肌肉脂肪酸组成发生改变，大菱鲆幼鱼的二十二碳六烯酸含量显著升高；李红艳等[16]研究发现，大菱鲆幼鱼饲料中浒苔(Enteromorphaprolifera)添加量为5%时，其饲喂效果较好。类似的结果在花鲈(Lateolabraxjaponicus)[17]、金头鲷(Sparusaurata)仔稚鱼[18-19]、大西洋鲑(Salmosalar)幼鱼[20]等研究中均有发现。

大菱鲆是世界上公认的优质比目鱼之一，内脏团小，出肉率高，肌肉丰厚白嫩，味道鲜美，营养丰富，是我国北方主要的养殖经济鱼类，其商品化饲料高度依赖鱼粉和鱼油，是进行鱼油替代的理想鱼种。因此本试验旨在探究饲料中添加拟微绿球藻粉替代鱼油对大菱鲆幼鱼血清生化指标、体组成和脂肪酸组成的影响，以期为微藻在水产饲料中的实际应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验设计

以大豆浓缩蛋白和白鱼粉为主要蛋白源，以拟微绿球藻粉等梯度替代大菱鲆幼鱼饲料中的鱼油，分别替代基础饲料中0(对照组)、8%、16%、24%和32%的鱼油，配制5种等氮等能的试验饲料。饲料配方、营养组成和脂肪酸组成见表1、表2。

1.2 饲料制作

所有饲料原料粉碎过80目筛，按照饲料配方称量质量后由小到大逐级定量均匀混合，随后加入适量的蒸馏水和鱼油二次均匀混合，挤压制成5 mm粒径的饲料，60 ℃烘干后，于-80 ℃冰箱保存备用。

1.3 饲养管理及样品采集

养殖试验在山东省海洋资源与环境研究院养殖实验室进行，为期37 d，采用全封闭水循环系统。试验鱼购自蓬莱宗哲养殖场，种质来源相同、规格均匀、健康无病，平均体质量(82.64±0.32) g。正式试验前，大菱鲆幼鱼在养殖系统中驯养2周，期间投喂对照组饲料，然后随机分为5组，每组设3个重复，每个重复25尾鱼，放养于直径80 cm、高70 cm、水深约50 cm的绿色圆柱形养殖桶中，每种饲料随机投喂3个桶。每日定时定量投喂2次(8:00，15:30)，投喂量为鱼体质量的1%～2%，根据摄食情况调整投喂量，投喂结束约30 min排残饵，统计并计算残饵量。养殖过程水温控制在(15.9±0.5) ℃，pH 7.8～8.2，盐度28～30，溶解氧>5 mg/L，氨氮、亚硝酸氮均<0.1 mg/L。

养殖试验结束后，禁食24 h，随机取3尾用于全鱼体组成常规分析，剩下随机取10尾静脉取血，随后的试验鱼分离内脏、肝脏和背肌，背肌和肝脏-20 ℃保存，用于常规分析。以上取样均在冰盒上进行，血样在4 ℃冰箱静置4 h，4000 r/min，离心10 min，取上清液，-80 ℃保存，用于测定血清生理生化指标。

1.4 测定指标和方法

饲料及组织样品中，水分采用105 ℃烘干恒等质量法测定(GB/T 6435—2006)；粗蛋白采用凯氏定氮法测定(GB/T 6432—2006)；饲料中粗脂肪和组织样品的粗脂肪采用索氏抽提法测定(GB/T 6433—2006)；粗灰分采用马弗炉550 ℃灼烧法测定(GB/T 6438—2007)；能量采用燃烧法测定(C6000，IKA，德国)。

表1 饲料配方及营养组成(干物质基础) %

注：a.白鱼粉(干物质)：粗蛋白含量65.47%，粗脂肪含量7.20%. b.大豆浓缩蛋白(干物质):粗蛋白含量69.85%，粗脂肪含量2.10%. c.矿物质预混料(mg/kg)：MgSO4·7H2O, 3568.0; NaH2PO4·2H2O, 25 568.0; KCl, 3020.5; KAl(SO4)2, 8.3; CoCl2, 28.0; ZnSO4·7H2O, 353.0; CaCO3, 15 968.0; CuSO4·5H2O, 9.0; KI, 7.0; MnSO4·4H2O, 63.1; Na2SeO3, 1.5; C6H5O7Fe·5H2O,1533.0; NaCl, 100.0 mg; NaF, 4.0. d.维生素预混料(mg/kg)：维生素A, 38.0; 维生素D, 13.2; α-生育酚, 210.0; 硫胺素, 115.0; 核黄素, 380.0; 盐酸吡哆醇, 88.0; 泛酸, 368.0; 烟酸, 1030.0; 生物素, 10.0; 叶酸, 20.0; 维生素B12, 1.3; 肌醇, 4000.0; 抗坏血酸, 500.0. e.拟微绿球藻粉(干物质)：粗蛋白50.72%, 粗脂肪18.05%, 购自烟台海融生物技术有限公司.

表2 试验饲料脂肪酸组成 %

血清中高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯、胆固醇采用全自动生化分析仪(7020，日立，日本)进行测定。血清总超氧化物歧化酶、总抗氧化能力和溶菌酶均采用南京建成的试剂盒测定。

1.5 样品中脂肪酸分析

脂肪酸测定方法参照文献[21]的方法并稍作改进。肌肉和肝脏样品真空冷冻干燥48 h后，磨成粉末，称取约0.1 g的样品放入50 mL螺口试管中，加入内标0.5 mL，甲醇盐酸3 mL，正己烷1 mL，封口后轻轻振荡，70 ℃金属浴甲酯化2 h后，冷却10 min至室温，加入5 mL 6% K2CO3，2 mL正己烷，充分振荡，取上层液于1.5 mL的离心管中，4000 r/m，离心5 min，取0.6 mL甲酯化的脂肪酸上机分析，使用岛津GC-2010高效气相色谱分析仪，采用氢火焰检测器。色谱条件参照文献[22]的条件。采用supelco 37种脂肪酸甲酯混标(supelco美国)识别样品脂肪酸，各脂肪酸相对含量采用面积归一化法计算。

1.6 数据统计分析

采用SPSS 18.0软件对数据进行单因素方差分析，当处理之间差异显著(P<0.05)时，用Duncan′s检验进行多重比较，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 拟微绿球藻粉替代鱼油对大菱鲆幼鱼肌肉、肝脏及全鱼常规营养组成的影响

拟微绿球藻粉替代鱼油显著影响大菱鲆幼鱼全鱼粗蛋白和粗脂肪含量，对粗灰分和水分的含量影响不显著(P>0.05)(表3)。试验组的全鱼粗蛋白含量显著高于对照组(P<0.05)，试验组的全鱼粗脂肪含量显著降低(P<0.05)。

拟微绿球藻粉替代鱼油显著影响大菱鲆幼鱼肌肉的粗蛋白和粗脂肪含量(P<0.05)，其趋势与全鱼结果相同，对粗灰分和水分的含量则影响不显著(P>0.05)。

表3 微藻粉替代鱼油对大菱鲆体组成的影响 %

注：同行数值后不同上标英文字母表示差异显著(P<0.05)，其他表同.

拟微绿球藻粉替代鱼油显著影响大菱鲆幼鱼肝脏的粗蛋白含量，替代8%试验组显著高于对照组(P<0.05)，对水分和粗脂肪影响不显著(P>0.05)。

2.2 微藻粉替代鱼油对大菱鲆幼鱼肌肉和肝脏脂肪酸的影响

肌肉中的主要脂肪酸分别为C14:0(2.65%～2.73%)、C16:0(19.32%～19.66%)、C18:0(6.18%～6.62%)、C18:1n-9(10.08%～10.43%)、C18:2n-6(6.94%～7.10%)、花生四烯酸(2.04%～2.55%)、二十碳五烯酸(7.32%～7.49%)和二十二碳六烯酸(24.10%～24.68%)(表4)。与对照组相比，肌肉饱和脂肪酸(28.36%～28.60%)、n-6多不饱和脂肪酸(9.08%～9.45%)、n-3多不饱和脂肪酸(33.20%～33.81)和n-3高不饱和脂肪酸(31.59%～32.10%)的百分含量与对照组差异不显著(P>0.05)，与对照组相比，试验组肌肉的单不饱和脂肪酸含量先升后降，在替代16%试验组达到最大值，对照组显著低于替代16%试验组(P<0.05)。

肝脏中的主要脂肪酸分别是C14:0(4.42%～5.02%)、C16:0(15.49%～19.07%)、C18:1n-9(12.59%～16.12%)、C18:2n-6(7.50%～7.97%)、C20:1(1.59%～2.07%)、花生四烯酸(1.43%～1.92%)、二十碳五烯酸(5.54%～7.22%)和二十二碳六烯酸(13.56%～14.89%)(表5)。试验组肝脏的单不饱和脂肪酸和n-3/n-6高不饱和脂肪酸含量呈下降趋势，替代32%试验组达到最小值，并显著低于对照组(P<0.05)。

2.4 微藻粉替代鱼油对大菱鲆幼鱼生理指标的影响

血清中总超氧化物歧化酶和总抗氧化能力呈先升后降的趋势，在替代16%试验组达到最大值并且显著高于对照组(P<0.05)，血清中溶菌酶也呈先升后降的趋势，替代16%试验组和替代24%试验组显著高于对照组(P<0.05)，血清中丙二醛呈先降后升的趋势，在替代16%试验组达到最低值并且显著低于对照组(P<0.05)，血清中低密度脂蛋白胆固醇呈下降趋势，试验组显著低于对照组(P<0.05)，血清中甘油三酯和总胆固醇呈下降趋势，替代24%试验组和替代32%试验组显著低于对照组(P<0.05)(表6)。

表4 微藻粉替代鱼油对大菱鲆幼鱼肌肉脂肪酸的影响 %

表5 微藻粉替代鱼油对大菱鲆幼鱼肝脏脂肪酸的影响 %

表6 微藻粉替代鱼油对大菱鲆幼鱼生理指标的影响

3 讨论

3.1 拟微绿球藻粉替代鱼油对大菱鲆幼鱼体组成的影响

试验结果显示，拟微绿球藻粉替代鱼油对大菱鲆幼鱼全鱼水分影响不显著，这与张燕等[23]的研究结果一致，说明添加不同的脂肪源饲料对全鱼的水分影响不显著。随着拟微绿球藻粉的等比例增加，试验组全鱼粗蛋白含量呈先升后降的趋势，在替代16%试验组达到最大值，且显著高于对照组，出现蛋白质沉积增加的原因可能与饲料中花生四烯酸的添加量有关，这与谭青等[24]对大菱鲆的研究结果一致。全鱼粗蛋白储存随着饲料中花生四烯酸添加量变化而变化，花生四烯酸含量在1.00%～1.21%时显著高于对照组(0.78%)。本研究中，花生四烯酸的变化主要来源于拟微绿球藻粉的变化，说明在饲料中添加适量的拟微绿球藻粉有利于蛋白质的沉积。试验组全鱼粗脂肪含量呈逐渐下降的趋势并且显著低于对照组，这与王成强等[25]对花鲈的研究结果相一致，花鲈鱼体粗脂肪含量随着饲料中花生四烯酸含量升高呈下降趋势，粗蛋白含量则呈现相反趋势，本试验大菱鲆幼鱼肌肉组成也有类似的趋势。粗脂肪含量下降的原因可能有两个方面。一方面拟微绿球藻粉替代鱼油造成饲料的脂肪酸不平衡，而花生四烯酸与脂肪代谢密切相关，花生四烯酸通过抑制载体蛋白apoB100分子的分泌来抑制极低密度脂蛋白的组装，从而达到调控肝脏脂肪转运，进而影响脂肪在肌肉中的有效沉积[26]。试验中花生四烯酸含量随着拟微绿球藻粉的增加呈上升趋势，对照组花生四烯酸含量最低，导致对照组饲料脂肪利用效率低下，脂肪沉积量上升，试验组花生四烯酸含量增多，外源饲料获得的营养无法满足试验组大菱鲆幼鱼需要时，通过动用自身的脂肪储能物质以维持正常的生长需要，可能导致了大菱鲆幼鱼全鱼粗脂肪含量降低[27-28]。另一方面拟微绿球藻脂肪含量虽然较高,但二十碳五烯酸占总脂肪酸的35%，其他大多数均为色素[23]，故而沉积的脂肪较少，这说明本试验条件下大菱鲆幼鱼饲料中添加拟微绿球藻粉，有利于蛋白质的沉积，且降低了脂肪的有效沉积。

3.2 拟微绿球藻粉替代鱼油对大菱鲆幼鱼肌肉和肝脏脂肪酸组成的影响

本研究发现，鱼体的肌肉和肝脏的脂肪酸组成和饲料的脂肪酸组成有一定的相似性，这与彭墨等[29]研究结果相似，说明在适量的替代水平下肝脏和肌肉脂肪酸组成与饲料脂肪酸组成相似，但也有些特殊的脂肪酸会被优先保留或者利用[30]。试验组的肌肉饱和脂肪酸(28.36%～28.60%)、n-6多不饱和脂肪酸(9.08%～9.45%)、n-3多不饱和脂肪酸(33.20%～33.81%)和n-3高不饱和脂肪酸(31.59%～32.10%)的含量与对照组无显著差异，肌肉中单不饱和脂肪酸含量随替代水平的增加呈先升后降的趋势，替代水平为16%时达到最大值，已有的研究表明，单不饱和脂肪酸更易于被β-氧化而加以利用[31-33]，这说明可能有些脂肪酸含量过高时，会被优先代谢利用[34]。高不饱和脂肪酸[35-36]主要为n-6和n-3两个系列，n-6系列主要为花生四烯酸，n-3系列主要为二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，均为海水鱼必需脂肪酸[31]。随着拟微绿球藻粉等比例的增加，肌肉中n-3/n-6高不饱和脂肪酸水平呈逐渐降低趋势，且替代水平为24%和32%的试验组显著低于对照组，出现显著差异的原因是肌肉中花生四烯酸呈逐渐上升的趋势，特别是替代水平在24%和32%的试验组显著高于对照组，而二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的含量在各处理之间并无显著变化，这就导致n-3/n-6高不饱和脂肪酸水平出现显著差异，这与半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)[37]和塞内加尔鳎(Soleasenegalensis)[28]的研究结果类似。

本研究中，试验组肝脏的n-3多不饱和脂肪酸(9.25%～9.59%)和n-3高不饱和脂肪酸(22.42%～23.01%)的含量与对照组无显著差异。肝脏中的n-6多不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸的含量均呈逐渐上升的趋势，替代水平为24%和32%时达最大值且显著高于对照组，而单不饱和脂肪酸含量总体呈下降趋势，与鱼体可优先消化吸收饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸，而多不饱和脂肪酸倾向于富集在体内这一研究结果[38]相符，饱和脂肪酸呈上升趋势而非被优先消化吸收，可能相比单不饱和脂肪酸更难被β-氧化[31-33]。肝脏中二十碳五烯酸呈逐渐上升后趋于平稳的趋势并显著高于对照组，而花生四烯酸上升的趋势要慢于二十碳五烯酸，在替代水平为24%时才显著高于对照组。其原因可能为，在海水鱼体内脂肪酸的代谢竞争主要在花生四烯酸和二十碳五烯酸之间，它们可以相互产生竞争性抑制，本试验饲料中二十碳五烯酸含量更高时，由二十碳五烯酸生成的类二十烷酸的活性更强反而能抑制花生四烯酸的活性[39]，导致二十碳五烯酸更易富集在体内。肝脏中n-3/n-6高不饱和脂肪酸与肌肉中n-3/n-6高不饱和脂肪酸变化趋势相近，但替代32%试验组显著低于替代24%试验组，这主要与肝脏中花生四烯酸和二十碳五烯酸的变化有关，替代32%试验组肝脏花生四烯酸的含量远高于替代24%试验组，而二十碳五烯酸的含量并无显著差异，可能替代水平为24%时，花生四烯酸对二十碳五烯酸开始具有抑制作用[40]，因此n-3/n-6高不饱和脂肪酸在替代24%试验组和32%试验组出现显著差异。

3.3 拟微绿球藻粉替代鱼油对大菱鲆幼鱼血清生化指标的影响

本试验通过测定血清生化指标探究拟微绿球藻粉对大菱鲆幼鱼的抗氧化能力、非特异性免疫和脂类代谢能力的影响。试验结果与吴吉林等[9]的研究结果一致，拟微绿球藻粉含有丰富的天然色素，如玉米黄素和虾青素，可以增强免疫能力和抗氧化能力。大菱鲆幼鱼血清中总超氧化物歧化酶和总抗氧化能力呈先升后降的趋势，在替代水平为16%时达到最大值且显著高于对照组，说明拟微绿球藻粉替代鱼油可以提高大菱鲆幼鱼的抗氧化能力，替代水平为16%时达到最大值；本试验大菱鲆血清中的丙二醛含量呈先降后升的趋势，在替代16%试验组达到最低值且显著低于对照组，说明拟微绿球藻粉替代鱼油可以有效地减少大菱鲆幼鱼中脂质过氧化物的形成，替代水平在16%时达到最小值。本试验血清中溶菌酶含量也呈先升后降的趋势，替代16%试验组和替代24%试验组显著高于对照组，说明拟微绿球藻粉替代鱼油可以提高大菱鲆幼鱼的非特异免疫力，替代水平在16%和24%时达最大值；试验鱼机体脂类代谢情况主要参考血清甘油三酯和胆固醇的含量，与饲料中的脂肪水平呈正相关[41]。血清中的甘油三酯和胆固醇呈下降趋势，替代24%试验组和替代32%试验组显著低于对照组，这可能有两方面的原因：一是拟微绿球藻粉中有一部分是色素,机体对这部分脂类物质的吸收利用率很低，导致脂肪沉积率低[31]；二是血清中高密度脂蛋白负责将血液中的胆固醇转运到肝脏，而低密度脂蛋白负责将胆固醇和甘油三酯转运到血液，二者共同影响了血清中胆固醇和甘油三酯的含量[42]。在本试验中，与对照组相比，试验组的高密度脂蛋白胆固醇无显著变化，而低密度脂蛋白胆固醇含量逐渐下降，甘油三脂和总胆固醇的变化趋势与低密度脂蛋白胆固醇一致，这表明低密度脂蛋白胆固醇的下降减少了胆固醇自肝脏至血清的运输，从而降低了血清中甘油三酯和胆固醇的含量。因此，添加适量拟微绿球藻粉可以降低大菱鲆的血脂水平，有利于大菱鲆的血脂健康。