李仁燕 杨学妞 李练兵 马明福 徐晓鸥

1.重庆市人口和计划生育科学技术研究院，国家卫生计生委出生缺陷与生殖健康重点实验室(400020)；2.重庆市人口和计划生育科学技术研究院附属医院

复发性流产(RM)一般指与同一配偶发生连续≥3次自然流产，目前已知的常见病因有免疫因素、凝血功能异常、染色体异常等，因其发病机制复杂，治疗进程缓慢，所以一直是国内外基础与临床研究的难点与热点。同时由于RM患者常感到内疚、羞耻及孤立等，影响婚姻关系和生活状态[1]。维生素D(VD)是一种脂溶性维生素，主要在暴露于阳光下的皮肤中合成，来自饮食中的量比较少要与VD结合蛋白(VDBP)结合，但也可以通过与血清白蛋白和脂蛋白结合，运输到肝脏。在肝脏中VD通过线粒体形式的25-羟化酶进行第一次酶促转化，产生25(OH)D，这是VD在体内的主要循环活性形式。第二次酶促转化主要在肾脏中，经1α-羟化酶(CYP27B1)和24α-羟化酶(CYP24)产生1,25-二羟基维生素D或1,25(OH)2D，这是VD的活性代谢产物[3]。1,25(OH)2D通过与其具有特异性和高亲和力的VD受体(VDR)介导发挥作用。VDR是类固醇-甲状腺激素的核受体超家族的成员，广泛存在于人体的多种组织细胞中，如子宫、卵巢、胎盘等部位，主要介导VD对靶细胞的生物学效应。近年来，国内外多项研究表明，VD除了经典的维持钙磷平衡外，在人类生殖过程中还具有免疫调节作用。研究表明，当调整了孕妇的年龄、种族、BMI及胚胎的移植数后，卵泡液中的25(OH)D水平可以作为独立预测辅助生殖体外受精成败的指标；当VD严重缺乏时(<10 ng/ml)，将导致临床妊娠率降低2倍，而卵泡液中25(OH)D的水平每增加1 ng/ml，其临床成功妊娠的几率将增加6%[4]。VD缺乏可引起女性生殖内分泌紊乱，妊娠早期孕妇VD水平下降容易引起流产，甚至可能影响胎儿的生长发育。本文对近年来由于VD缺乏导致的RM的机制及其研究进展进行综述。

1 VD对RM的免疫抑制机制

从生殖免疫学的角度，妊娠属于一种同种异体移植的过程，依赖于母体对胎儿的正确识别和免疫耐受，而RM的发生则是同种异体移植失败的表现[5]。VD通过促进母体对胚胎产生免疫耐受，避免母体对胚胎发生免疫排斥反应，促进成功妊娠。临床上，将VD水平进行分类，以25(OH)D水平<50nmol/L定义为缺乏，将20～30ng/ml(50～75nmol/L)定义为不足，>30ng/ml(>75nmol/L)定义为正常[1]。目前关于VD促进成功妊娠的途径主要有以下3个方面：降低自身抗体，Th1/Th2型的Th2型细胞因子偏移，及NK细胞数量、功能异常等。

1.1 降低自身抗体

自身免疫型RM主要与4种疾病的4种自身抗体相关，抗磷脂抗体综合征[抗磷脂抗体(APA)]、系统性红斑狼疮[抗核抗体( ANA)]、干燥综合征(抗可抽提的核抗原抗体)、甲状腺自身免疫性疾病[甲状腺抗体,包括甲状腺过氧化物酶抗体(TPO-Ab)和甲状腺球蛋白抗体(TG-Ab)][6-7]。研究表明，在RM患者中，VD含量与APA，ANA及TPO-Ab水平呈显著负相关[8]。VD通过抑制活化的B细胞的持续增殖及诱导B细胞凋亡，调节自身抗体产生，而VD缺乏可诱导B细胞过度活化，介导自身抗体水平增加[9]，进而促使VD水平与自身免疫性疾病的易感性及严重程度密切相关[10]。既往研究发现，在VD<30ng/ml组的RM患者中，外周血CD19+B细胞水平明显高于VD>30ng/ml的RM患者[8]，升高的CD19+B细胞是自身免疫激活的表现，进而不利于成功妊娠[11-12]。从以上研究中推测，VD通过调节B淋巴细胞增殖及其功能的发挥，影响自身免疫抗体的产生，进而影响妊娠过程，但其具体机制仍需进一步探讨。

1.2 调控TH1/TH2比例偏移

根据妊娠中的Th1/Th2模式，Th1细胞表现为细胞免疫，Th2细胞促进体液免疫。在正常妊娠过程中，当Th2型细胞因子(如IL-4，IL-5，IL-6，IL-9，IL-10 及IL-13)占主导地位时，则增强母体体液免疫功能，抑制母体细胞免疫发生，促进成功妊娠。但当Th1细胞因子(如IFN-γ、IL-2及TNF-α)占主导地位时，可减少免疫营养因子的产生，抑制胎盘滋养细胞的生长和诱导胎儿-母体界面血栓形成和炎症的发生等，并破坏母体免疫耐受，导致流产的发生[13]。研究证实VD可调控活化T细胞，促进其分化及免疫耐受[14]，抑制Th1细胞增殖并限制其产生细胞因子，诱导Th2型细胞因子产生[15]。但体外实验证实，VD的浓度为20ng/ml或50nmol/L时，不足以引起Th1/Th2比例的改变，只有当VD浓度达到100nmol/L才可引起Th1/Th2的转变[15]。而VD在RM患者体内如何调控Th1/Th2型细胞因子产生，需要进一步深入研究。

1.3 调控NK细胞数量及功能

NK细胞为异质性细胞群体，通过自然杀伤和细胞毒性反应对同种异体抗原发挥细胞毒作用，可在绒毛间隙中与绒毛直接接触并杀伤胚胎[16]。因此，NK细胞的数量与毒性对妊娠的建立与维持及胎盘的发育具有重要作用。早期妊娠女性其外周血NK细胞活性显著低于非妊娠女性，且在RM患者外周血中NK细胞数量与毒性均显著增加[17]，同时在核型正常情况下，孕前检查外周血NK细胞水平，能够预测下次妊娠结局[18]，在妊娠中NK细胞水平升高还可预测RM[19]，以上结果表明，NK细胞的数量与毒性的降低可促进成功妊娠，而NK细胞数量与毒性的增加是导致RM的重要因素之一[20]。研究发现，NK细胞数量及细胞毒性与VD水平呈负相关[8]，同时25(OH)D<30ng/ml组外周血CD56+百分比高于25(OH)D>30ng/ml组，推测VD同时参与NK细胞数量和细胞毒性的调控[21]。

2 研究进展

根据检测VD取样位点的差异，将目前研究主要分成3个部分：外周血、子宫内膜、母胎界面，下面将从以上3个部分分别阐述VD的研究进展。

2.1 外周血

Chen等[22]对比分析了35名血清中VD水平正常的RM患者与64名VD≤30ng/ml的RM患者，结果显示，VD≤30ng/ml的RM组中，B细胞百分比、NK细胞毒性均高于VD正常的孕妇。在孕4～10周，检测了98例孕早期血清中25(OH)D3含量，对胎儿流产进行了预测，结果显示，对妊娠女性进行早期血清25(OH)D3水平检测，对胎儿流产的预测率为80%[23]。对比分析136例自然流产孕妇与60例正常体检的孕妇血清中25(OH)D水平差异，结果发现，自然流产组25(OH)D的缺乏率为44.12%，正常组25(OH)D缺乏率为26.67%，差异有统计学意义，表明25(OH)D的缺乏可能增加自然流产的发生[24]。

2.2 子宫内膜和母胎界面

大部分研究都集中在外周血中进行检测，但胎儿与母亲之间形成的微环境对成功妊娠更关键。因此，检测RM患者子宫内膜及胎儿-母体界面的VD水平，对准确分析VD对妊娠的重要性至关重要。

Tavakoli等[25]研究了RM患者子宫内膜的VD代谢情况，通过对8名RM患者与8名年龄匹配的女性，利用活检刮匙获得的子宫内膜样本，发现子宫内膜间质细胞的细胞核中高表达VDR，细胞质中高表达CYP27B1，表明子宫内膜间质细胞是VD作用的靶细胞。在RM组的子宫内膜细胞中，IFN-γ的表达显著高于对照组，该研究还表明，VD能够调节炎症反应引起的免疫效应[25]。该团队随后的研究还表明，在RM组与正常对照组中，子宫内膜的VDR，CYP27B1及CYP24A1表达无显著差异，且子宫内膜将25(OH)3转换成1，25(OH)2D3的能力是一致的[26]。结果提示，在RM与正常对照组女性的子宫内膜中，VD的受体及相关酶的量与功能是无差异的。

有研究比较了40名RM患者与40名孕龄相匹配并自愿终止妊娠(此前至少有1次成功妊娠，且无自然流产经历)的女性，取其绒毛膜绒毛和蜕膜检测VDR的mRNA与蛋白的表达水平，结果表明，RM组的VDR表达水平显著低于正常对照组，提示VDR在RM组的胎儿-母体界面表达水平降低，对妊娠不利，同时检测出血清中的VDR水平也降低，因此血清中的VDR含量能预测胎儿-母体界面的VDR表达水平[27]。该团队进一步研究发现，CYP27B1在绒毛和蜕膜组织中均表达，且CYP27B1的mRNA与蛋白表达水平在RM组中显著低于对照组，同时，在RM组中，IL-10显著低于对照组，而TNF-α，IL-2与INF-γ显著高于对照组的绒毛和蜕膜组织，表明CYP27B1在胚胎植入过程中发挥局部关键作用[28]。Li等[29]检测了RM患者蜕膜组织，VDR水平明显降低，但CYP27B1的表达无显著差异，该研究结果与Wang等[28]相反，因此，需要通过研究进一步证实在蜕膜组织中CYP27B1的表达水平。通过对不同取样位点VD、VDR及相关酶表达水平的检测，进一步验证了VD在预测与预防RM中的重要作用。

3 治疗

由于VD不足者RM的患病率较VD含量正常者显著升高，这可能与免疫失调相关，因此对RM的女性可通过补充VD以利于妊娠。Chen等[22]用1,25(OH)2D治疗VD<30ng/ml的RM女性2个月，降低了B细胞百分比和NK细胞毒性。Ota等[30]研究显示，RM女性补充1,25(OH)2D3组与仅载体(不含VD)处理组比较，载体组显示更高的NK细胞毒性，而服用VD后，下调了TNF-α与INF-γ，可改善NK细胞免疫功能及促进RM女性成功妊娠。Ibrahim等[31]利用VD的免疫调节作用，预防RM再次发生，对40名RM孕妇(孕周≤6周)随机分成2组，接受口服VD3类似物补充剂(0.25 mcg，2次/d)，孕酮直肠栓剂(400 mg/d)，低剂量阿司匹林(81 mg/d)和叶酸(5mg/d的研究组)，和除VD3外接受相同治疗的对照组，服用至孕14周的结果显示，口服VD3类似物组的IFN-γ水平显著降低，RM降低约15%的风险。Samimi等[32]研究了VD补充剂在RM患者中的作用，将77名有RM史的孕妇随机分成接受口服VD(400 U/d)和阴道放置黄体酮(400mg/d)的研究组，和接受无活性成分的类似于VD3片剂和阴道放置黄体酮(400mg/d)的对照组，研究结果表明，VD可以减少女性RM的发生率。另外也有对99例VD<30ng/ml的RM患者补充1,25(OH)2D，可降低NK细胞毒性[33]。

母体对VD的摄入量是常人的1～2倍，因此在全世界都普遍存在妊娠期母体血清VD水平较低，不利于胎儿生长甚至可能流产等，然而关于VD与免疫性RM之间的关联及机制仍需进一步深入研究。在RM患者孕前或孕早期补充VD，有助于妊娠，也可作为一种新的辅助治疗RM的方案。但在临床实践中，关于应在孕前还是孕早期补充VD以及补充VD的剂量，都需进一步系统研究。