沙小梅，肖万榕，叶云花，涂宗财,3*，危紫徽，潘凤涛，潘海艳，张露，刘尧，季中春

1(江西师范大学 功能有机小分子教育部重点实验室&生命科学学院，江西 南昌，330022) 2(江西师范大学 体育学院，江西 南昌，330022) 3(南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌，330047) 4(盐城市怡美食品有限公司，江苏 盐城，224300)

鱼骨富含钙、磷和蛋白质等成分，营养价值十分丰富[1]，添加于食品中，可以增加食品的营养价值[2]。对鱼骨进行超微细化加工是促进鱼骨和食品基质有机融合，提升鱼骨利用价值的有效手段，目前，对鱼骨进行超微细化的技术主要有球磨法[3-4]、酶法结合超微粉碎技术[5]等。课题组前期运用亚临界水技术实现了鲢鱼鱼骨的软化[6]，若能进一步对软化后鲢鱼鱼骨进行超微细化处理，将有望拓展鱼骨的用途。

动态高压微射流(dynamichighpressuremicrofluidization,DHPM)作为一种集输送、混合、超微粉碎、加压、膨化等多种单元操作于一体的新兴动态高压均质技术[7]，其处理条件(如高速剪切、压力梯度、高速冲撞等)十分剧烈，易导致大分子聚合物发生降解[8-10]。DHPM处理能有效地改善蛋白质的溶解性、稳定性、起泡性、乳化性和致敏性[11]等，同时改变蛋白质和酶的结构和构象[12]；DHPM处理能改变淀粉的凝胶硬度、弹性、内聚性、胶着性和咀嚼性等[13]，并且能使非淀粉多糖分子降解，改变其表观黏度、凝胶性能、吸水性、持水性、流动性、粒径等性质[14]。目前运用DHPM超微细化鲢鱼鱼骨的研究还较少。

本文以亚临界水处理后的鱼骨为原料，利用DHPM不同压力和次数处理，研究DHPM处理对鲢鱼鱼骨粒度分布、微观结构、表面疏水性、游离氨基含量和钙离子溶出量的影响，为鱼骨的超微细化提供依据，为鱼骨的精深加工提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

鲢鱼鱼骨，购自洪湖市井力水产食品股份有限公司；其他试剂均属于分析纯。

1.1.2 仪器与设备

M-7125型动态高压微射流设备，美国Microfluidics公司；BioTek Synergy H1全功能酶标仪，美国BioTek仪器有限公司；BT-9300HT激光粒度分布仪，辽宁丹东百特仪器有限公司；S-3400N扫描电子显微镜，日本日立(HITACHI)有限公司；YXQ-LS-100SII立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 鱼骨的预处理

将冷冻的鲢鱼鱼骨置于室温约25 ℃下解冻，用沸水加热1 min，将鱼骨表面残存的鱼肉和膜性组织剔除，经蒸馏水冲洗干净后，置于37 ℃的烘箱中烘12 h，用自封袋封好放入-20 ℃冰箱中备用。

1.2.2 鱼骨的软化

根据课题组前期研究结果，采用亚临界水技术结合醋酸软化鲢鱼鱼骨[6]，即将鱼骨与0.9 mg/L醋酸以料液比1∶25(g∶mL)混合，采用亚临界水处理，温度设定为124 ℃，时间设定为1.5 h。

1.2.3 DHPM对鱼骨进行超微细化处理

(1)将软化后鱼骨先经过胶体磨和均质机预处理，再分别进行0、40、60、80、100、120 MPa的DHPM处理3次，研究不同的DHPM压力对亚临界水处理后鱼骨细化效果的影响。

(2)将软化后鱼骨先经过胶体磨和均质机预处理，再于100 MPa的DHPM压力下分别处理0、1、3、5、7次，研究不同的DHPM处理次数对亚临界水处理后鱼骨细化效果的影响。

1.2.4 鱼骨粒度的测定

用蒸馏水将鱼骨配制为1.0 mg/mL的溶液，采用纳米激光粒度仪测定鱼骨在溶液中的粒度分布[15]。以鱼骨样品的数量百分比为横坐标，粒径为纵坐标绘制曲线，研究DHPM处理对鱼骨粒度分布的影响。

1.2.5 微观结构

将DHPM处理后的鱼骨溶液冻干成鱼骨粉，将鱼骨粉样品置于样品台的导电双面胶上，采用扫描电镜在低真空模式下放大5 000倍拍摄鱼骨粉的微观结构[16]。

1.2.6 表面疏水性

采用ANS荧光探针法测定不同DHPM处理条件下鱼骨粉表面疏水性的变化[17]。采用超纯水溶解冻干过后的鱼骨粉得到系列浓度的鱼骨样品溶液，取4 mL样品溶液与20 μL 8 mmol/L ANS溶液(0.01 mol/L，pH 8.0)混合后，测定其荧光强度。测定条件：激发波长为370 nm，发射波长为400～600 nm，扫描速度为2 400 nm/min，激发和发射的狭缝宽度均为5 nm，电压为400 V。以鱼骨粉浓度(mg/mL)为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，采用线性回归分析进行曲线拟合，曲线的斜率即为鱼骨粉的表面疏水性(H0)。

1.2.7 鱼骨中钙含量的测定

将DHPM处理的鱼骨溶液离心取上清液后，用蒸馏水稀释一定倍数，加入3 mL三乙醇胺和5 mL氨性溶液，然后滴入2滴铬黑T指示剂，最后以0.02 mol/L的EDTA标准溶液滴定，当溶液由酒红色变成蓝色即为滴定终点，根据标准回归方程求解溶液中的钙离子含量，平行测量3次[18]。

1.2.8 鱼骨中游离氨基含量的测定

参考SERPEN等[19]的方法并稍作修改，鱼骨中游离氨基的含量采用OPA法测定。准确称取40.0 mg的OPA溶解于1.0 mL甲醇中，再加入200 g/L的十二烷基硫酸(SDS) 2.5 mL、硼砂(0.1 mol/L) 25.0 mL和β-巯基乙醇100 μL，最后用蒸馏水定容到 50 mL，即为OPA试剂，此试剂要现配现用。测定时，将DHPM处理的鱼骨溶液离心取上清液作为样品待用，取1.0 mL OPA试剂于试管中，加入50 μL样品，混合均匀，放入35 ℃水浴中反应2 min后在340 nm下测吸光度(A340nm)，另取1.0 mL OPA试剂于试管中，加入50 μL水作为空白对照。用相同的方法，以甘氨酸代替样品作出标准曲线，根据曲线计算样品中游离氨基的含量。

2 结果与分析

2.1 DHPM处理对鱼骨粒度分布的影响

DHPM处理对鱼骨粒度分布的影响如图1所示，结果表明，不同DHPM处理压力和处理次数都能显著地减小鱼骨的粒径。经0、40、60、80、100和120 MPa的DHPM处理后，鱼骨的D97(即鱼骨颗粒累计粒度分布百分数达到97%时所对应的粒径)分别为88.39、39.07、34.8、27.19、24.71和25.89 μm。经DHPM处理0、1、3、5和7次后，鱼骨的D97分别为88.39、33.7、24.71、24.69和25.39 μm。由图1-A可知，鱼骨的粒径随DHPM处理压力的增大而减小，当压力增加到100 MPa时，粒径达到最小，降低至未经DHPM处理时鱼骨颗粒D97的28%。而后，随着压力的增大，120 MPa的DHPM处理后鱼骨颗粒的D97有所增大。这表明DHPM处理过程中的强力剪切，高速冲击和高频振动等作用能有效降低鱼骨颗粒的大小，然而，当DHPM处理压力为120 MPa时，鱼骨颗粒可能在范德华力、静电相互作用力等影响下重新聚集，导致鱼骨粒径稍有增加。这一结果与DHPM处理后玉米淀粉[20]、乳清蛋白[21]、大豆膳食纤维[22]等粒径变化结果相一致。由图1-B可知，当DHPM处理压力不变(100 MPa)，鱼骨的粒径随DHPM处理次数的增加而减小，当处理次数为3～5次时粒径达到最小。随着DHPM处理次数的进一步增加，鱼骨的粒径呈现出小幅度增大趋势，当处理次数为7次时D97为25.39 μm，可能是因为过度的处理在一定程度上促使鱼骨分子间发生聚集，高频的聚集现象和极高的能量密度使鱼骨颗粒产生了“过处理现象”[23]。

A-DHPM处理压力对鱼骨粒度分布的影响； B-DHPM处理次数对鱼骨粒度分布的影响图1 DHPM处理对鱼骨粒度分布的影响Fig.1 The effect of DHPM on particle size distribution of fish bone

2.2 DHPM处理对鱼骨微观结构的影响

DHPM处理对鱼骨微观结构的影响如图2、图3所示。结果表明，DHPM处理能有效细化鲢鱼鱼骨。图2为不同DHPM压力处理后鱼骨的扫描电镜图，未经处理的鱼骨样品为薄片状。DHPM处理后，鱼骨的整体结构被破坏，伴随着颗粒状碎片的出现。随着DHPM处理压力的增加，碎片颗粒的粒径逐渐减小。当DHPM处理压力为80～100 MPa时，鱼骨的颗粒最多、粒径最小。然而，100 MPa DHPM处理后的鱼骨部分碎片颗粒呈现聚集现象。这与钟俊桢等[24]所研究的动态高压微射流对β-乳球蛋白微观结构的影响有相似之处：随着DHPM处理压力的逐渐增大，β-乳球蛋白分子被逐渐打散，大部分颗粒逐渐变细，然而有小部分β-乳球蛋白分子在经过100 MPa处理后，发生了部分团聚现象。当处理压力为120 MPa时，聚集现象明显增加，大部分颗粒粘连在一起，团聚成片状。这与纳米激光粒度仪检测溶液中鱼骨粒度分布的结果一致。

图3为不同次数DHPM处理后鱼骨的扫描电镜图，由图可知，未经处理的鱼骨样品微观结构呈现出片状薄片。随着DHPM处理次数的增加，鱼骨的片状微观结构被破坏，鱼骨碎片颗粒的粒径先减小后增大。当DHPM处理次数为3次时，鱼骨颗粒的外观形貌最小。然而，当DHPM处理次数为5～7次时，鱼骨表面出现典型的聚集现象，鱼骨颗粒间已发生明显粘连和团聚，即出现“过处理现象”[23]。

A-0 MPa; B-40 MPa; C-60 MPa; D-80 MPa; E-100 MPa; F-120 MPa图2 不同压力DHPM处理后鱼骨的扫描电镜图Fig.2 The scanning electron microscope photographs of fish bone treated by DHPM with different pressures

A-0次;B-1次;C-3次;D-5次;E-7次图3 不同次数DHPM处理后鱼骨的扫描电镜图Fig.3 The scanning electron microscope photographs of fish bone treated by DHPM with different times

2.3 DHPM处理对鱼骨表面疏水性的影响

鱼骨中的蛋白质大多数为Ⅰ型胶原蛋白，其空间结构会影响表面疏水性[25]。DHPM处理能改变蛋白质的高级结构，使蛋白质发生去折叠[26]，因此，本文进一步研究了DHPM处理对鱼骨表面疏水性的影响，结果如图4所示。随着DHPM处理压力的增加，鱼骨表面疏水性先增加后降低(p<0.05)，在40 MPa时达到最大值。出现这种现象的原因可能是DHPM处理使鱼骨中蛋白质分子的空间结构发生变化，破坏了其内部的疏水相互作用，使疏水基团暴露，从而大大提高了鱼骨的表面疏水性。而经过60～80 MPa的DHPM处理后，由于鱼骨颗粒的分散，分子间的亲水区域被暴露，导致表面疏水性的下降[27]。之后随处理压力增大，鱼骨颗粒的聚集可能导致部分蛋白质分子聚集，疏水基团被掩蔽，使其表面疏水性再次降低。这一现象与迟玉杰等[28]所研究的动态高压微射流对蛋清蛋白表面疏水性的影响相似。由图4-B可知，DHPM处理压力不变(100 MPa)时，处理次数的不同对鱼骨表面疏水性会产生不同的影响。当处理次数为1次时，其表面疏水性高于未经处理的鱼骨样品(p<0.05)，SHEN等[29]研究表明，DHPM处理能使蛋白质发生去折叠、暴露内部疏水基团，从而提高表面疏水性。而随处理次数的增加，鱼骨表面疏水性均低于未经处理的样品。可能的原因是随处理次数的增加，蛋白质将会聚集，其内部疏水基团被掩蔽[28]，导致疏水性低于未经处理的鱼骨样品(p<0.05)。

A-不同处理压力对鱼骨表面疏水性的影响； B-不同处理次数对鱼骨表面疏水性的影响图4 DHPM处理对鱼骨表面疏水性的影响Fig.4 The effect of DHPM treatment on the surface hydrophobicity of fish bone

2.4 DHPM处理对鱼骨钙离子含量的影响

DHPM处理对鱼骨钙离子含量的影响如图5所示。由图5-A可知，鱼骨中钙离子含量随DHPM处理压力的增加，整体呈现先升高后降低的趋势，并在处理压力为80 MPa时，鱼骨中钙离子含量达到最大值。原因可能是继亚临界水处理后，40～80 MPa的DHPM处理进一步破坏了鱼骨内部胶原纤维的网状结构和羟基磷灰石结晶的结构，有利于钙离子更大程度地析出[30]。而当压力高于80 MPa时，过高的压力使得鱼骨部分碎片颗粒呈现聚集现象，导致鱼骨内部结构变得更加紧凑，不利于钙离子的析出，从而使钙离子含量降低。DHPM处理次数对鱼骨中钙离子溶出量的影响如图5-B所示，当DHPM处理次数为1次时，鱼骨中钙离子溶出量较对照组稍有降低，但变化程度不大。随着DHPM处理次数的增加，鱼骨中钙离子溶出量增加，然而DHPM处理3、5和7次的鱼骨钙离子溶出量无显著性变化。可能是由于多次的DHPM处理已使鱼骨颗粒与水分子发生充分接触，因而钙离子溶出量呈现出稳定值。

A-不同处理压力对鱼骨钙离子含量的影响； B-不同处理次数对鱼骨钙离子含量的影响图5 DHPM处理对鱼骨钙离子含量的影响Fig.5 The effect of DHPM treatment on the calcium ion content of fish bone

2.5 DHPM处理对鱼骨游离氨基含量的影响

DHPM处理对鱼骨游离氨基含量的影响如图6所示。鱼骨经不同处理压力和次数的DHPM处理后，游离氨基含量均有所降低。由图6-A可知，当DHPM处理压力从40 MPa增加到60 MPa时，可能由于鱼骨颗粒的分散，蛋白质分子摆脱束缚，游离氨基含量呈现出增加的趋势(p<0.05)。然而，随着压力的进一步增加，鱼骨中蛋白质分子发生去折叠，部分游离氨基被包裹，导致游离氨基含量表现出降低的趋势[31](p<0.05)。DHPM处理压力达到120 MPa时，游离氨基含量有所上升，据郭丽萍利用超高压结合热处理对猪肉蛋白的研究可知，压力可以稳定氢键，使蛋白质的结构趋于稳定，而静电相互作用和疏水相互作用在压力的作用下被削弱，可导致蛋白质有序结构的减少，无序结构增多[32]，这一现象会引起游离氨基含量的上升。由图6-B可知，鱼骨游离氨基含量随DHPM处理次数的增加呈现出先降低后增加的趋势(p<0.05)，并在处理次数达到5次时，游离氨基含量达到最低。出现该现象的原因可能是DHPM处理次数的增加导致鱼骨颗粒聚集，部分游离氨基被包裹，使其含量降低，之后当处理次数达到7次时，静电相互作用和疏水相互作用在压力的作用下被削弱，使蛋白质有序结构减少，无序结构增多[32]，导致游离氨基含量再次增加。

A-不同处理压力对鱼骨游离氨基含量的影响； B-不同处理次数对鱼骨游离氨基含量的影响图6 DHPM处理对鱼骨游离氨基含量的影响Fig36 The effect of DHPM treatment on the calcium ion content of fish bone

3 结论

本文研究了DHPM处理对鱼骨超微细化后理化性质及结构的影响。研究结果表明：随着处理压力和处理次数的增大，鱼骨粒径明显减小。当DHPM处理压力为100 MPa、处理次数为3～5次时，粒径达到最小。扫描电镜图像显示鱼骨经DHPM处理后，其表面形貌发生改变，片状结构被破坏形成小颗粒，继而出现凝聚现象。DHPM处理能显著改变鱼骨的表面疏水性和钙离子含量。经80 MPa的DHPM处理3次后，鱼骨钙离子含量达到最大值；经40 MPa的DHPM处理3次后，鱼骨表面疏水性达到最大值。经不同处理压力和次数的DHPM处理后，鱼骨游离氨基含量均有所降低。当DHPM处理压力为100 MPa、处理次数为5次时，游离氨基含量达到最低。上述结果表明DHPM处理能有效降低鱼骨的粒度，影响鱼骨的理化性质和结构。