武海峰 吕远达 郑海霞 赵明晶 王家庆

摘要：以德国鸢尾（Iris germanica. L）FRANS HALS叶片、球茎作为外植体，利用正交试验设计研究探讨不同激素及不同浓度组合对鸢尾愈伤组织的诱导、不定芽分化以及试管苗生根的影响，为鸢尾快速繁殖、种质资源的保存及利用提供最优的技术方法。结果表明，不同外植体灭菌时间也不同，叶片为3%次氯酸钠3 min，球茎为3%次氯酸钠5 min;鸢尾组培快繁的最适合外植体为球茎;鸢尾愈伤组织诱导和芽分化的最适培养基配方为MS+NAA 0.10 mg/L+6-BA 1.00 mg/L，生根培养基为MS+1＼2MS+NAA 0.10 mg/L，试管苗移栽基质采用泥炭∶珍珠岩=8∶2，成活率达90%以上。

关键词：鸢尾（Iris germanica. L）;组织培养;外植体;植株再生

中图分类号：Q949.71+8.28         文獻标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）23-0223-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.23.055           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Research on tissue culture and plantlet regeneration of Iris germanica ‘FRANS HALS

WU Hai-feng1，LYV Yuan-da2，ZHENG Hai-xia1，ZHAO Ming-jing1，WANG Jia-qing1

（1.Shenyang Institute of Technology，Fushun 113122，Liaoning，China;

2.Institute of Fruit Tree Research，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510640，China）

Abstract： Using the leaves and bulbs of Iris germanica 'FRANS HALS' as explants， orthogonal experiment was used to study the effects of different hormones and different concentration combinations on the induction of callus， adventitious bud differentiation and rooting of test-tube seedlings to provide an optimized method for rapid propagation， preservation and utilization of germplasm resources of the iris. The results showed that the sterilization time required for different explants was different. The leaves were 3% sodium hypochlorite for 3 min and the bulbs were 3% sodium hypochlorite for 5 min. The most suitable explants for appendix tissue culture were bulbs. The optimum medium for callus induction and bud differentiation of Iris was MS+NAA 0.10 mg/L+6-BA 1.00 mg/L; rooting medium was MS+1＼2MS+NAA 0.10 mg/L; the substrate was peat∶ perlite=8∶2， and the survival rate was over 90%.

Key words： Iris germanica. L; tissue culture; explant; plantlet regeneration

德国鸢尾（Iris germanica. L）是鸢尾科鸢尾属多年生草本，单子叶常绿植物。鸢尾叶片碧绿青翠，花形大而奇特[1]，宛若翩翩彩蝶，是庭园中的重要花卉之一，也是优美的盆花、切花和花坛用花，其花色非常丰富，也可用作地被植物，有些鸢尾种类的鸢尾是优良的鲜切花材料。鸢尾花卉品种有几千种，在北美和西欧鲜切花及优良庭园品种的推广多是通过快速繁殖供应市场[2]。一般情况下，鸢尾主要靠根茎传统的方法繁殖，但此方法繁殖效率低、品种混杂，远远不能满足市场需求，严重影响了经济效益[3，4]。通过植物组织培养不仅可以快速繁殖优质种苗，还可以很高效地解决传统繁殖中产生的问题。参考国内外有关德国鸢尾组织培养的报道可以发现，德国鸢尾繁殖的研究结果较少且差异较大，德国鸢尾组织培养存在污染率高、不定芽诱导困难、繁殖效率低等问题[5-7]。国内德国鸢尾试管苗未实现商业化生产[8]。本研究以优良耐寒纯种德国鸢尾新品种FRANS HALS为试材，探讨建立组培快繁体系的适宜条件，为其试管苗的工厂化生产提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  材料

德国鸢尾（Iris germanica. L）FRANS HALS由沈阳工学院园艺设施中心研究室提供。

1.2  方法

1.2.1  鸢尾外植体的选取  选择生长健壮的植株幼嫩叶片以及球茎作为外植体，首先用自来水冲洗干净，剪去残叶、根系，于10%洗衣粉溶液中浸泡30 min，并不断搅拌，再用流水冲洗干净，在纯净水中冲洗3次，置于超净工作台上。在接种前于75%乙醇中浸泡30 s，无菌水冲洗3次，再用0.3%次氯酸钠溶液浸泡3～5 min后，无菌水冲洗3～5次，用无菌滤纸吸干水分，将外植体切割成1 cm×1 cm小块作为接种的外植体。每个处理9瓶，每瓶3个外植体，重复3次。培养7 d后调查污染情况，污染率=（污染外植体数/接种外植体数）×100%，死亡率=（死亡外植体数/接种外植体数）×100%。鸢尾球茎初代培养情况见图1。

1.2.2  愈伤组织诱导和不定芽分化培养基的筛选  取备用的外植体，消毒灭菌后，将外植体分别接入事先采用正交试验设计方案（表1）配制好的初代培养基中，进行诱导愈伤和分化。将其放入人工气候培养箱中进行培养，所设光温湿条件均为最适宜条件。不同外植体部位（叶片、球茎）分别接种外植体20块，每瓶2个外植体，重复3次，15 d继代1次，20 d后统计出愈率。出愈率=（有愈伤组织形成的外植体数/接种外植体数）×100%。40 d后观察记录芽分化情况，统计分化率。分化率=（有芽形成的外植体数/接种的愈伤组织块数）×100%。鸢尾球茎愈伤组织与继代单株不定芽分化情况见图2。

1.2.3  生根培养  生根培养以NAA作为诱导激素，具体设计如表1所示。将2～3 cm长的健壮芽切割下来，使之成为单株无根苗，然后接种至不同生根培养基上，每种培养基接种20个芽，15 d后观察根生长状况，统计生根率。生根率=（有根形成的芽数/接种芽数）×100%。当继代的组培苗长到3～5 cm时选取健壮的小苗切割接种到生根培养基中，然后放入人工气候培养箱中培养，观察生长状况，当根长达到3 cm的时候，可将其进行出瓶移栽。鸢尾试管苗的生根情况见图3。

1.2.4  组培苗的移栽与驯化  当根长达到3 cm以上，芽长3～4 cm时，采用闭口全光照炼苗。1周后，打开瓶盖，进行开口炼苗，并按时旋转封口膜，2 d后，将封口膜取下并向三角瓶内注入少量水，放于通风处。3 d后，取出组培苗移植到不同配比的基质中进行炼苗，基质体积比分别是泥炭∶珍珠岩=8∶2、黑土∶珍珠岩=7∶3、田园土∶黑土=7∶3。塑料薄膜覆盖保湿，并用遮阳网遮光，15 d后调查移栽成活率。成活率=（成活苗数/移栽总苗数）×100%。

1.2.5  培养基的配制及培养条件  以MS培养基为基础培养基，每升加琼脂7.5 g，蔗糖30 g，加入不同梯度激素，pH调至5.8，分装于100 mL玻璃三角瓶中，加膜扎紧封口，然后放入高压灭菌锅中，121 ℃下灭菌20 min。放在温度为（26±1） ℃，光照强度为2 000 lx的环境条件下培养，光照12 h/d。

2  结果与分析

2.1  不同3%次氯酸钠消毒时间对外植体接种的影响

由表2可知，随3%次氯酸钠处理时间的增加，外植体污染率显著降低，处理5 min和处理8 min的污染率均较低，分别为18.5%和14.8%，处理3 min的死亡率则较低，为7.4%，而处理10 min时，对外植体损伤较大，死亡率为29.6%，显著高于处理3 min，因此，采用3%次氯酸钠消毒叶片的最佳处理时间为3 min。

由于鸢尾球茎在地下取出，杂菌比较多，因此3%次氯酸钠处理时间应比叶片延长。由表3可知，处理5 min和处理8 min的污染率均较低，分别为29.6%和22.2%;处理10 min时对外植体损伤较大，死亡率为25.9%，显著高于处理5 min，而处理5 min的死亡率则较比处理8 min低，为11.1%。因此，采用3%次氯酸钠消毒球茎的最佳处理时间为5 min。

2.2  不同培养基对外植体诱导愈伤组织的影响

按照正交设计进行8组试验，发现2种激素对于鸢尾的外植体诱导作用差异很大。从表4分析结果可知，在初代培养过程中，叶片、球茎两种外植体均能诱导产生愈伤组织，并且两种外植体愈伤组织诱导率都很高，但球茎高于叶片;从正交试验的结果分析中可以得出最优外植体为球茎。正交表中最好的方案为6号试验，也就是A2B1C2组合。鸢尾快速增殖的最佳培养基配方为MS+NAA 0.10 mg/L+6-BA 1.00 mg/L。

2.3  生根培养

当增殖苗长至3 cm左右时，在无菌条件下，切下带少量愈伤组织的单芽，接种于预备好的生根培養基中，观察其生长情况。10 d左右开始生根，20 d后根长1～2 cm，4号培养基上根系生长速度较快。调查各培养基中根系生长情况，各培养基均有生根，具体情况见表5。因此，确定最佳生根培养基为4号培养基，即MS+1＼2MS+NAA 0.10 mg/L。

2.4  炼苗移栽

待根生长到3～5 cm时，将小苗进行炼苗、移栽、定植。移栽前首先要进行透气训练，然后将组培苗根系所黏附的培养基冲洗干净，经过驯化的组培苗，叶片已形成角质层，可以有效地防止体内水分的蒸发，抵抗外界杂菌的侵染。这时可以将其移栽到常用的基质上，进行常规管理。移栽结果表明，试管苗在珍珠岩中移栽成活率最高，达90%。

3  讨论

德国鸢尾组织培养的外植体常采用茎尖或花的器官[9]，不仅存活率低，而且对母株的伤害比较大，因此不适宜作离体培养的外植体[10]。本试验利用叶片、球茎为外植体进行德国鸢尾组织培养，与茎尖为外植体相比，球茎作初代培养的外植体具有取材方便、材料丰富、消毒方便、不损伤母本植株、能保存母本品种优良性状等优点。

激素对细胞的分化起着重要的调节作用，生长素和细胞分裂素的比例控制着细胞的分化和器官的形成，高质量浓度细胞分裂素与低质量浓度的生长素有利于芽的形成;反之则促进生根。6-BA是植物组织培养常用的细胞分裂素[11]，NAA是常用的生长素，本研究在MS中加入NAA和6-BA浓度配比的培养基，外植体均能发生愈伤组织。愈伤组织诱导和芽分化均在同一种培养基上进行。鸢尾叶片与球茎外植体分化芽的能力取决于培养基中生长素和细胞分裂素的浓度比例。本试验中，愈伤组织的分化率在两种激素的不同浓度组合间存在很大的差异。

在炼苗试验过程中，试管苗的成活率受诸多因素的影响，鸢尾移栽成活率在很大程度上取决于栽培基质，3种不同栽培基质对植株成活率影响不同。应选择易取得、好用、通风排水佳、不易酸化腐烂和易植且便宜的栽培基质。

4  结论

本试验以德国鸢尾叶片、球茎为研究对象，研究不同激素及其不同浓度组合对鸢尾叶片、球茎愈伤组织的诱导、不定芽分化及其生根的影响。试验结果表明，外植体选择过程中，以球茎作为外植体繁殖系数最大，成活率最高。鸢尾快速增殖的最佳培养基配方为MS+NAA 0.10 mg/L+6-BA 1.00 mg/L，生根培养基为MS+1＼2MS+NAA 0.10 mg/L，试管苗炼苗基质为泥炭∶珍珠岩=8∶2，成活率达90%以上。该研究结果为鸢尾快速繁殖试管苗的有效途径，可为鸢尾种苗的工厂化生产提供一定的依据。

参考文献：

[1] 黄苏珍，谢明云，佟海英，等.荷兰鸢尾（Iris xiphium L.var. hybridum）的组织培养[J].植物资源与环境，1999，8（3）：48-52.

[2] 黄苏珍，郭维明.中国鸢尾属观赏植物资源的研究与利用[J].中国野生植物资源研究，2003，22（1）：4-7.

[3] BRIAN M. The Iris[M].London：B T Batsford Ltd，1981.

[4] 黄  洁，马登萍.德国鸢尾的组织培养试验[J].青海农林科技，2008（1）：25-26.

[5] 黄苏珍，韩玉林，谢明云，等.德国鸢尾的组织培养[J].江苏林业科技，2000，27（6）：37-44.

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[7] 黄苏珍，韩玉林，谢明云，等.杂种鸢尾的组织培养与植株再生[J].植物生理学通讯，2003，39（6）：638.

[8] 郭晋燕，张金政，孙国峰，等.根茎鸢尾园艺学研究进展[J].园艺学报，2006，33（5）：1149-1156.

[9] 陈  晨，毕晓颖，卢明艳.德国鸢尾组织培养快速繁殖技术研究[J].沈阳农业大学学报，2010，41（1）：27-32.

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[11] 宗憲春，许向阳，张  贺，等.潘那利番茄叶片组织培养及植株再生研究[J].东北农业大学学报，2011，42（4）：62-65.