董 浩,姜 萌,杨一鸣,张林波,张文慧

(吉林农业大学生命科学学院,吉林 长春 130118)

致病性细小病毒大多为单股DNA病毒[1],分类地位主要集中在细小病毒科,按国际病毒分类委员会(ICTV)编写的分类报告,根据各种细小病毒侵染的宿主不同,可将细小病毒科分为两个亚科,分别是侵染脊椎动物的细小病毒亚科(Parvovirinae)和侵染昆虫等节肢动物的浓核病毒亚科(Densovirinae)[2]。近年来流行较为严重的犬、猪和鹅等细小病毒均具有很强的破坏力,传统疫苗的控制较为有限,加大新型疫苗的研制刻不容缓。

病毒样颗粒(VLPs)是一种不含有病原核酸,只通过病毒的一个或多个结构蛋白组成的空心颗粒[3]。其不能进行自我复制,只是在形态上与病毒相似,可以通过感染模式把抗原递呈给免疫细胞,有效的诱导机体的免疫系统发挥免疫功能,产生保护作用。目前活病毒疫苗的主要不足就是安全性不能完全保证,因此对于传染病的防护VLPs有着传统疫苗不可比拟的优势。

1 VLPs的结构及免疫机制

VLPs是通过病毒的1个或多个结构蛋白装配形成的具有一定规则(通常为二十面体或杆状)的超分子结构,直径在25 nm～100 nm之间。病毒的结构蛋白与包膜的结构特征决定了VLPs的免疫原性和抗原性。VLPs的特点是可以多层重复且高密度的把病原相关分子模式(PAMPs)展现出来,可以通过PAMPs激活固有免疫反应,被宿主细胞中的各种识别受体所识别,随后刺激巨噬细胞、树突状细胞等抗原递呈细胞进行抗原捕获,最后递呈给MHCⅡ类分子,激活一系列的免疫应答。一些外源性VLPs仍保留与原始病毒相近的受体结合位点,可以通过交叉递呈的方式通过MHCⅠ类途径进行递呈,使CD8+T细胞活化,实现CD8+T细胞介导的保护性免疫反应,这样可以更容易清除细胞内的病原体。另外,VLPs可通过交联B细胞膜表面免疫球蛋白从而诱导B细胞反应,还可有效刺激CD4+T细胞的增殖和细胞毒性T细胞反应。在某些情况下,VLPs可以直接激活B细胞受体和刺激T细胞非依赖性IgM反应。因此,只需要低剂量的VLPs就可以使免疫系统激活保护反应,从而显著的降低了疫苗的成本[4]。在疫苗安全方面,VLPs不含有病毒的核酸,从而消除了活病毒重现的风险,不会造成具有活力的病毒传播,疫苗也不存在毒力返祖、产生免疫缺陷等风险。VLPs除了疫苗功能以外,还可以作为一种抗原递呈载体,不同种的病毒结构基因通过基因工程手段整合到一起形成病毒样颗粒(VLPs),单个VLPs上嵌合多个免疫原性较低的可溶性抗原可以有效提高可溶性抗原的免疫原性。还可以,分别表达外源抗原和VLPs,然后通过化学方法以共价或非共价的方式将其偶联至VLPs表面,也可以设计外源抗原的结合位点,这些抗原包括环肽、短肽等蛋白抗原以及半抗原、多糖等非蛋白抗原[5]。

2 细小病毒VLPs的研究现状

目前,国内外主要集中在以下细小病毒的VLPs研究：犬细小病毒(CPV)、猪细小病毒(PPV)、人细小病毒B19(B19)、鹅细小病毒(GPV)等病毒的研究。

2.1 犬细小病毒VLPs的研究进展 犬细小病毒是细小病毒科细小病毒属成员,具有细小病毒属病毒典型形态和结构[6]。CPV可引起犬急性出血性肠炎和急性心肌炎,发病率和病死率高,对犬及狐等经济动物具有极大的危害。CPV是一类结构简单的线状单链DNA病毒,形态呈六角形或圆形,等轴对称的二十面体,直径约为20 nm,衣壳蛋白无囊膜,不含脂质或糖类[7]。

CPV VLPs的制备通常是利用病毒结构蛋白VP2表达后组装而获得的。目前常用的表达体系主要分为真核表达体系和原核表达体系,真核包含昆虫细胞表达系统和酵母表达系统,而原核主要是大肠杆菌表达系统。目前比较成熟的CPV VLPs利用真核表达系统的为多,主要原因是真核系统有利于实现外源蛋白翻译后的修饰和折叠,表达的重组VP2结构蛋白具有天然的分子构象,利于VLPs的形成。Feng[8]等利用CPV的VP2蛋白在杆状病毒表达系统表达,并在昆虫细胞和蛹中组装成病毒样颗粒。VLPs的电子显微照片显示,与野生型细小病毒相比,它们的大小和形态非常相似。同时,该学者又在小鼠和狗中研究了VLPs的免疫原性,结果表明,CPV-VLPs刺激细胞和体液免疫应答。Xu[9]等利用小泛素样修饰(SUMO)融合模序在大肠杆菌中表达CPV的整体天然VP2蛋白,在融合模序切割后,CPV VP2蛋白自组装成VLPs,获得的VLPs具有类似真实病毒衣壳的大小和形状。免疫试验结果表明,VLPs可以有效地诱导抗CPV特异性抗体和淋巴细胞增殖。另外,也有学者利用CPV VLPs作为生物载体来应用,王斌[10]利用PCR的方法将犬细小病毒的衣壳蛋白VP2基因扩增链接到pSMK载体质粒上,利用大肠杆菌表达系统得到可溶性的VP2蛋白,然后自组装成病毒样颗粒特性。在体外环境下,以VLP为原料将MPA修饰后的量子点MPA-QDs包裹进入病毒样颗粒内部,形成具有良好生物相容性,且无生物毒性的荧光复合物 CPV VLPs-QD。

2.2 猪细小病毒VLPs的研究进展 猪细小病毒所致的繁殖障碍是世界养猪业面临的问题,一旦病毒侵入易感猪群,发病率非常之高。PPV是单股负链DNA病毒,无囊膜,病毒粒子大小22 nm～25 nm,由60个衣壳蛋白亚基组成,结构呈二十面体等轴对称[11]。PPV基因组大小约5.0 kb,末端约有120 bp～200 bp的回文结构[12]。

PPV的VLPs制备也主要从结构基因VP2表达蛋白入手,常用的表达体系主要包含酵母表达体系,比如Tamosiunas[13]等使用来自猪血清的病毒核酸提取物扩增编码PPV主要衣壳蛋白VP2的基因,并将其插入到酿酒酵母表达质粒中,重组PPV VP2蛋白在酵母中有效表达,纯化后的PPV VP2蛋白的电子显微镜分析显示病毒样颗粒(VLP)自组装。产生针对重组PPV VP2蛋白的9种单克隆抗体(MAb)。通过PPV感染细胞的免疫荧光分析证实了新产生的MAb的特异性。利用间接ELISA进行评估,结果表明,具有很高的灵敏度和特异度。另外也有通过杆状病毒-昆虫细胞表达体系进行组装的,Antonis[14]等用杆状病毒表达载体系统(BEVS)产生的由重组病毒样颗粒(PPV-VLP)组成的针对猪细小病毒(PPV)的新型疫苗,测试其免疫原性和保护效力,结果表明,在矿物油佐剂中的亚微量的PPV-VLP的制剂在用作参考模型的豚鼠和目标物种猪中诱发高血清抗体滴度。再有,PPV VLPs可以与外源抗原嵌合,为开发预防和控制猪病的多联苗提供了可能,陈杨[15]等采用脂质体介导法将PPV VP2与猪伪狂犬病病毒DNA共转染Vero细胞,重组病毒PRV SA215/VP2株,电镜观察表明,感染的Vero细胞中可同时观察到PRV与PPV两种类病毒样颗粒,成功实现了利用PRV载体表达PPV VP2蛋白病毒样颗粒。

2.3 人细小病毒B19 VLPs的研究进展 人细小病毒B19颗粒直径为23 nm,无囊膜包裹,病毒基因组是由3 500个碱基组成的单链DNA,B19病毒在分子生物学上有独特性,末端回文序列长达365个碱基,G、C含量高,使得B19病毒二级结构牢固,而不易克隆入细菌中。B19病毒同其他小DNA病毒一样有种属特异性。有两种壳蛋白：VP1(83 kDa)和VP2(58 kDa),VP2占优势,VP1位于壳体外部,易与抗体结合。

B19病毒的组装既可以在真核表达体系中完成,也可以在原核表达体系中完成。邹小辉[16]等采用昆虫杆状病毒表达系统,成功制备了人细小病毒B19病毒样颗粒,在透射电镜下可见直径约22 nm的VLPs。Sanchez-Rodriguez[17]等报道了在大肠杆菌中表达的重组VP2蛋白的B19 VLP的体外自组装以及pH值和离子强度对组装过程的影响,研究结果表明,VP2能够在体外完全形成VLP。在中性pH值下,均匀的VLPs在酸性和碱性pH值下组装,离子强度低,主要组件是小型中间体。体外自组装的VLPs在37℃下是高度稳定的,并且在80℃下30分钟后,大部分颗粒保持组装。B19病毒也被用来作为异源DNA的载体,在药物和其他生物分子医学成像中有着很大的应用前景,Sanchez-Rodriguez[18]等将不同大小的异源线性dsDNA片段封装到B19 V-VP2 VLP中的,其中将DNA和变性VP2蛋白共孵育,并通过一次透析步骤进行装配过程,开启了使用这种VLP作为具有未来治疗应用传递系统的可能性。

2.4 鹅细小病毒VLPs的研究进展 鹅细小病毒GPV直径20～22 nm、无囊膜、二十面体对称的病毒,在分类学上属于细小病毒科(Parvoviridae),细小病毒亚科(Parvovirinae),依赖病毒属(Dependovirus)的成员,GPV基因组全长约为5.2 kb,为单链、线性DNA。GPV基因组的一大特点是正负链DNA分子都具有回文序列。GPV总共编码3种结构蛋白,分别是VP1、VP2和VP3。

GPV的VLPs的获得多采用真核表达体系。Ju.H[19]等通过PCR扩增了GPV VP的基因,并使用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达重组VPs蛋白,电子显微镜显示在昆虫细胞中自发组装成VLPs,免疫实验也证明获得的VLPs具有较好的免疫原性。Chen.Z[20]等将野生型VP2密码子转化为在昆虫基因中更常见的密码子,使用杆状病毒表达系统(BES)表达GPV的主要衣壳蛋白VP2组装成病毒样颗粒(VLP)。透射电镜结果显示VLP的形成,免疫原性测定结果显示,VLP是高度免疫原性的,引起高水平的中和抗体并提供针对致死性攻击的保护。

3 展望

细小病毒的VLPs主要由病毒的结构蛋白VP2自组装备成的不含遗传物质的空心颗粒,由于没有DNA,病毒无法复制和增殖,也就不具备感染致病的能力,因此安全性也是传统的活疫苗和弱毒苗所不能比拟的。另外由于VLPs可以出色的模拟病毒粒子的结构,与天然病毒具有相同的免疫原性,可以刺激机体产生持久的免疫反应。因此VLPs作为一种未来的新型疫苗是值得期待的。但目前在颗粒制备上也存在一些技术难题,不管是哪种表达体系,获得VLPs的过程就较繁琐,获得率又很低,这阻碍了病毒样颗粒疫苗向临床试验的转化,因此开发新型的表达体系,探索影响表达系统VLPs组装过程的影响因素,是目前最为重要的研究方向。此外,VLPs的生物载体特性也得到了很好的应用,通过化学偶联或者生物包被等方式把异源基因,药物,量子点及纳米颗粒等整合到VLPs上,为研究生物靶向治疗和生物纳米成像等方面提供材料。