朱春玲,李 梅,刘 丽,刘少龙,夏小静,王 青,徐彦召,杭柏林,孙亚伟,胡建和,王 磊

(河南科技学院动物科技学院,河南 新乡 453003)

近年来,由于传统抗生素的滥用,药物残留及耐药性问题日益严重,时刻威胁着人类的健康,寻找新的抗菌药物迫在眉睫。抗菌肽是一类分子量相对较小并由基因编码核糖体合成的生物活性肽[1]。Boman G.等人发现第1个天然抗菌肽天蚕素以来,便开启了抗菌肽研究的黄金时代。随着抗菌肽研究的不断深入,人们发现抗菌肽具有抗菌、抗病毒、抗癌、调节凋亡以及加快伤口愈合的功能。然而,天然抗菌肽的生产成本高、细胞选择性差,限制了天然多肽在临床上的应用[2],另外,如何进行规模化生产和纯化仍是限制抗菌肽开发的技术瓶颈。为充分提高抗菌肽的利用效率,基因工程技术已经应用到抗菌肽的研发过程中,在本文中,我们将对抗菌肽真核表达系统、原核表达系统和人工设计化学合成等进行综述,以期为抗菌肽的工业化生产提供参考。

1 真核表达系统

1.1 酵母表达系统 目前,已有500多种外源蛋白在酵母表达系统中获得表达,Sang M[3]等为探究ABP-Dhc-cecropin A线性阳离子肽表达的新方法,将ABP-Dhc-cecropin A基因重组到pPICZ αA载体上,通过电击的方法将质粒转入毕赤酵母体内,在适宜培养条件下成功表达了浓度为48 mg/L的ABPDhc-cecropin A线性阳离子肽。Xing L W[4]研究发现Fowlicidins是鸡体内一组重要的抗菌肽,在鸡先天免疫中具有防御作用,并广泛表达在各个组织中。为获得大量的Fowlicidins,该实验组人员将毕赤酵母X-33与表达载体pPICZ αA重组,成功构建携带Fowlicidin-2基因的表达系统,在优化的发酵条件下Fowlicidin-2的浓度可达85.6 mg/L,纯度大于95%。Lui D P[5]等人完整的设计了一个抗菌肽Abaecin,并对其密码子进行优化,通过pPic9表达载体,将Abaecin基因亚克隆至毕赤酵母基因组内,甲醇诱导激活,结果发现,重组表达的Abaecin可以有效抑制大肠杆菌的生长。毕赤酵母等真核表达体系具有翻译后的加工修饰功能,表达的蛋白更接近于天然蛋白,能够克服原核表达系统低表达包涵体的缺点,目前,利用毕赤酵母表达系统已经进行了多种抗菌肽的表达。然而,毕赤酵母等真核表达体系也存在缺陷,比如产物复杂,不易纯化,且表达的成本较高。

1.2 转基因植物表达系统 转基因植物表达系统由于其高效性已被广泛使用。转基因植物疫苗和药用蛋白的表达系统有很多,其中农杆菌介导的植物表达系统、植物病毒瞬时表达系统以及叶绿体表达系统最为常用。目前转基因植物在生产经济蛋白质方面具有相当大的市场潜力,而且转基因植物生产的药物在临床试验中表现出低免疫原性[6]。

农杆菌介导的植物表达系统是一种利用天然的转化载体系统,具有表达成功率高和产物活性好的优点。Lee l H[7]等人将人类的LL-37多功能抗菌肽基因通过pPZP载体引入农杆菌基因组中,并通过农杆菌介导作用将目的抗菌肽基因转入水稻中,结果表明,LL37能够在转基因水稻中高效表达,且能够显著抑制水稻叶枯病的发生。Chahardoli M[8]等人将重组的牛乳铁蛋白通过发根农杆菌转入到烟草毛根部,证实重组牛乳铁蛋白在发根中存在,并对大肠杆菌有良好的抑制作用。Song D[9]等人将兔defensin NP-1基因通过农杆菌介导进入莴苣体内,结果发现转基因莴苣能够对枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌起到较强抑制作用。另外,在植物中表达宿主病毒的抗体抑制植物其他病原感染的有效手段之一。Jung Y J[10]等人将多肽Hcap18/LL-37基因融合到花椰菜花叶病毒控制的前导序列,借助花椰菜花叶病毒将Hcap18/LL-37基因转入白菜体内,成功表达人类抗菌肽hCAP/LL-37,转基因白菜具有不同程度的抗细菌及真菌的能力。

Retrocyclin-101(RC101)和Protegrin-1(PG1)是治疗细菌或病毒感染的两种有效抗菌肽,但其化学合成价格昂贵,Lee S B[11]等人创建了Retrocyclin-101(RC101)和Protegrin-1(PG1)基因编码的叶绿体转化载体,证实Retrocyclin-101(RC101)稳定的整合到烟草叶绿体基因组中,结果发现,RC101和PG1基因表达的可溶性蛋白含量分别可达32%～38%、17%～26%,叶绿体表达系统获取的抗菌肽效率比有机萃取高10倍以上[11]。并且比生物表达系统和化学合成便宜且收益率更高,随着技术的发展,转基因技术已成为实验的常用手段之一。

1.3 昆虫细胞表达系统 迄今为止,昆虫是世界上最大的生物种群,超过一半的抗菌肽来自于昆虫。自20世纪70年代初,瑞典科学家Boman等首先从惜古比天蚕中获得抗菌肽,并确定天蚕素A和B的一级结构顺序,昆虫免疫进入一个崭新时期。昆虫细胞是重组杆状病毒的天然宿主之一,被广泛用于重组蛋白的表达及人类和兽医生物制品的制备,对质粒介导的瞬时转染具有遗传稳定性。杆状病毒表达载体系统在过去的三十多年里已经发展为表达外源蛋白最广泛的系统之一。Snakin-1(StSN1)是一种从茄属植物中提取的一种广谱性抗菌肽,结果表明,该抗菌肽在使用细菌及酵母表达系统时均不能有效的解决生产低效的问题。Almasia N I[12]等人将Snakin-1(StSN1)优化基因重组到杆状病毒并感染草地贪夜蛾Sf9细胞,得到重组Snakin-1多肽,将这些蛋白注射到小鼠体内,小鼠可以产生抗Snakin-1的抗体。钙转运调节肽在钙的吸收过程中发挥重要作用,可以有效的控制细菌的生理活动。Phan T C[13]等人将Caltrin基因插入pcDNA3.1 v5/His-TOPO载体上,随后将Caltrin-his序列连接到转移载体pBacPAK9中,在昆虫细胞中进行高效表达caltrin(钙转运调节肽),结果发现,该重组蛋白表达效率高、特异性好。昆虫细胞表达系统是一种真核表达系统,安全性高,能够容纳较大的外源基因,具有完备的翻译后加工修饰系统和高效表达外源基因的能力。

1.4 动物细胞表达系统 哺乳动物体内含多种天然抗菌肽,对多种细菌有较强杀伤作用。哺乳动物是天然的抗菌肽来源库,大批量诱导合成是实现临床应用的一个有效途径。试验结果表明,抗菌肽Cecropin A-magainin在体外有明显的杀菌作用,为增强其抗菌能力并减少表达系统的毒副作用,Zhang J[14]等人将该基因通过腺病毒载体转入到小鼠巨噬细胞中,后期动物试验结果显示,重组巨噬细胞能够明显抑制细胞内细菌的生长,为控制细胞内感染提供了新方法。阳离子抗菌肽LL-37在肠黏膜防御方面具有重要作用,通常表达在表面上皮细胞和人类的浅层结肠上瘾窝,很少表达在深处的结肠隐窝或小肠上皮细胞。Sharma N[15]等人克隆牛的乳铁蛋白肽基因(Lactoferrin)并转到pIggyBac转座子载体上,在牛乳腺上皮干细胞中表达,结果发现,表达产物在对抗奶牛乳房炎病原菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌时效果显著。研究表明,pIggy-Bac转座子载体介导的乳铁蛋白肽在乳腺上皮干细胞或奶牛乳腺细胞中的表达为奶牛乳腺反应器奠定了基础。与其他的真核表达体系相比,哺乳动物细胞表达的蛋白与天然蛋白的结构、糖基化类型和方式几乎相同且能正确组装成多亚基蛋白,但成本较高。

1.5 衣藻表达载体 单细胞微生物如大肠杆菌、酵母等,都已用作外源基因表达载体,然而素有“绿色酵母”之称的衣藻在蛋白表达方面却相对滞后。Dong B[16]等人将3个串联Mytichitin-A重复序列基因转移到衣藻体内,研究显示,Mytichitin-A可溶性蛋白收益率达到0.28%且表达水平持续六个月以上,与天然抗菌肽和酵母表达系统相比,对革兰阴性菌的抑制效果更好且无细胞毒副作用,可以作为细胞工厂化生产Mytichitin-A。

2 原核表达载体

原核表达载体是基因工程中常用的一种,但由于宿主菌的选择性导致目的蛋白表达过少或不表达以及细胞毒性都限制了原核表达系统在合成抗菌肽中的使用。常用的抗菌肽原核表达系统如下：

2.1 大肠杆菌表达 大肠杆菌是原核表达最常用的载体之一。壳聚糖酶是一种专门水解壳寡糖的酶,且壳寡糖作为抗菌剂广泛应用于医药、食品、农业、坏境等领域。为提高壳聚糖酶产量,Kilani-Feki O[17]等人将枯草芽孢杆菌的壳聚糖酶相关基因(Chitosanase CSNV26 of Bacillus subtilis)通过pBAD载体转入大肠杆菌体内,这种蛋白在大肠杆菌内分泌量高达6.2 mg/L,活性研究发现,该蛋白可以引起真菌菌丝的改变甚至形成原生质体。抗菌肽PGLa-AM1具有较强的抗菌活性,但因产量低,难提纯等缺陷,限制了其广泛应用。Zhang X[18]等人将PGLa-AM1基因与家蚕蛋白基因融合,再将一个6×His的标签加到融合蛋白的末端,最后将融合的抗菌肽基因密码子优化克隆到大肠杆菌pET-30a(+)表达载体中,结果发现,其表达量高达30 mg/L。抗菌肽是先天性免疫活性物质,混合不同的抗菌肽在实际应用中具有较好的抗菌效果。WuR[19]等人混合蜂毒肽,将蜂毒肽的疏水性N端与LL37抗菌核心片段连在一起,并将其编码的DNA序列克隆到pEt-SUMO载体上,最后在大肠杆菌体内表达。经IPTG诱导,Ni-NTA裂解后,上清中SUMO-M-L可溶性蛋白含量约165 mg/L。

大肠杆菌是最早被使用也是研究最透彻的表达体系,目前仍是很多基因表达载体的首选。大肠杆菌生长迅速,易于培养,能够大规模表达外源基因而且成本较低。但是,其缺乏翻译后加工修饰功能,表达产物常以包涵体的形式存在,复性困难。

2.2 枯草芽孢杆菌表达系统 枯草芽孢杆菌也称枯草杆菌,是一类需氧型杆状革兰阳性菌。Abaecin是从蜜蜂体内得到的一种抗菌肽,它可以提高其他物种抗菌肽对细菌的杀伤作用。为了大量提取Abaecin,Li L[20]等将Abaecin基因与烟草蚀纹病毒蛋白酶基因重组,然后将优化重组的基因导入枯草芽孢杆菌,最终成功的获得抗菌肽Abaecin。Ji S[21]等人将 CAM-W 、EDDIE和信号肽SacB融合基因转移到由启动子Pg/v控制的pDM03载体中,转化到枯草芽孢杆菌内,形成高效表达的重组枯草芽孢杆菌WB700表达系统。结果发现,在成功表达的上清发酵液中Cecropin A-melittin浓度高达159 mg/L。枯草芽孢杆菌WB700表达系统具有分泌胞外完整生物活性蛋白的功能,而且该系统可以减少分泌蛋白在体外的降解。猪抗菌肽β-defensin-2(pBD-2)和Cecropin P1(CP1)在应激和抵御疾病方面发挥作用,Xu J[22]等人将 β-defensin-2(pBD-2)和 Cecropin P1(CP1)基因融合插入pMK4质粒并转移到枯草芽孢杆菌中,生成的枯草芽孢杆菌可以有效的表达融合抗菌肽,且在体外可以抵抗多种细菌的活动。枯草芽孢杆菌表达系统可在短时间内发酵,同时表达几种蛋白,且能够避免形成包涵体。

2.3 乳酸链球菌表达系统 乳酸链球菌肽也称乳酸链球菌素是由乳酸链球菌产生的小分子多肽物质。为了提高乳酸杆菌LS01的产量,Ni Z J[23]等人提出将nisRK和nisFEG基因连续融合成一个由启动子P32控制的单一穿梭表达载体pMG36e上,用电穿孔法将重组载体导入细胞中。琼脂扩散法检测乳酸链球菌肽的表达并以16s核糖体RNA为对照进行定量表达分析,结果表明,在给定条件下重组表达的乳酸链球菌肽比原始菌株增加50%以上。

2.4 链霉菌表达系统 链霉菌属于革兰阳性菌,广泛用于医药和农业领域,常见于土壤及腐败的植物中。链霉菌具有高效分泌胞外蛋白的能力,因此链霉菌在表达蛋白方面更具有独特优势。糖肽类抗生素是与D-丙氨酰-D-丙氨酸具有高度亲和性的七肽结构抗生素,通过抑制细胞壁的合成而致使细菌死亡,几乎对所有的革兰阳性菌均有较好的抗菌活性。为了高效率的表达糖肽类抗生素,Binda E[24]等人借助pIJ86载体将重组的糖肽类抗生素基因(Glycopeptide antibiotic)转入链霉菌属中表达,结果发现转基因链霉菌获得了更高的糖肽类抗生素表达量,而且与抗生素相比最小抑菌浓度较低,可以有效的抑制耐药菌株的生长。

2.5 干酪乳杆菌表达系统 干酪乳杆菌是公认的保健类肠道益生菌,在肠道内可长期存在并诱发机体的先天性和特异性免疫反应,研究发现其具有表达抗菌肽的潜力。Zhang L[25]等人将合成的基因片段PR39插入pPG：612表达载体然后转化到干酪乳杆菌393体内,结果发现,该干酪乳杆菌不仅对大肠杆菌和沙门菌有明显杀菌作用,且对金黄色葡萄球菌也有轻微的抑制效果。

3 展望

抗菌肽作为最具潜力的抗生素替代药物之一,由于其商品化产量不能满足市场需求,利用基因工程方法将有望实现这一目标。基因工程技术表达的抗菌肽虽然在结构上与天然的抗菌肽有所差异,但是其活性相似,甚至抗菌活性更强。但是各个系统又有所缺点,真核表达系统虽然能够高效表达,但产物较复杂,不易纯化且成本较高;原核表达系统虽然成本低,但缺乏翻译后的加工修饰,表达产物大多以包涵体的形式存在。随着抗菌机制及基因表达调控的不断深入,相信能够克服现有系统的种种缺陷,设计出更加高效的抗菌肽表达系统,为畜牧业的发展和人们的健康提供更好的保障。