肖湘君 肖义军

(福建师范大学生命科学学院 福州 350108)

1 植物病害与植物对病毒的交叉保护现象

植物病害是导致农作物减产的重要原因之一，而其中部分病害则由植物病毒引起。例如，大家熟悉的烟草花叶病毒可侵染烟草等茄科植物，引起叶片厚薄不匀，颜色黄绿相间，呈花叶状；发病早期的植株节间缩短，严重矮化，生长缓慢。水稻矮化病毒曾于1973—1977年间在菲律宾流行，导致部分地区水稻颗粒无收。

早在1928年就有人观察到，接种了烟草环斑病毒弱毒株的烟草，虽然接种叶出现坏死斑，但植株整体获得了对同种及相近种病毒的抗性[1]。研究发现，其他植物也大多存在类似现象，人们把此种现象称为交叉保护。这种现象与动物接种疫苗后产生对病毒的抗性很相似，但植物并不具备动物那样的免疫系统，也从未有人发现在植物体内有针对病毒的抗体存在，因此两者的机制并不一样。人们提出过好几种假说试图解释这种现象，但都无法得到证实。直到1990年，美国科学家Jorgensen等在研究矮牵牛花色变化时发现了RNA干扰现象，植物的交叉保护机制才得以最终阐明。

2 植物的抗病毒机制

植物在与病毒的长期斗争中进化出了多种多样的抗病毒机制，植物表面具有的角质层、蜡质层和细胞壁等物理屏障足以阻止大部分的病毒侵染，一些植物还通过突变使自身丧失病毒复制或运动所需的基因产物而导致病毒失去侵染力。不过，目前最受关注的植物抗病毒机制是RNA沉默和R基因介导的病毒抗性。

2.1 植物的RNA介导的病毒基因沉默机制 Jorgensen等为了得到花色更深的矮牵牛，将与花色形成密切相关的查耳酮合酶基因(CHS)导入到开紫花的野生型矮牵牛中，却意外地发现约有1/4的转基因后代开白花或紫白相间的花，其CHS基因的表达比野生型显著下调，他们当时推测可能是外源导入的CHS基因抑制了植物内源CHS基因的表达，这就是所谓的RNA沉默现象，即小RNA(sRNA)通过诱导与其互补的mRNA或病毒RNA的降解或翻译抑制、DNA或组蛋白修饰等过程，抑制靶基因的表达或翻译，使得靶基因沉默[2]。病毒RNA沉默现象是目前已阐明的植物抗病毒的重要机制之一。RNA沉默介导的植物抗病毒反应主要包括4个步骤： ①植物病毒(大多是RNA病毒)侵染入细胞后通过多种方式生成双链RNA(dsRNA)；②dsRNA经Dicer-样蛋白(Dicer是动物和真菌细胞的一种dsRNA特异性核糖核酸酶的内切酶，属于RNaseⅢ家族)切割加工成为18～25个bp的病毒sRNA；③成熟的病毒sRNA与argonaute蛋白(是RNA基因沉默途径中的核心元件，属于一个庞大的蛋白质家族)结合形成RNA诱导沉默复合体(RISC)；④在RISC中，病毒sRNA指导与其互补的病毒基因组的切割，从而抵抗病毒的入侵[3]，而这些沉默信号在受感染的细胞中产生后可通过胞间连丝扩散至邻近细胞，再沿着筛管组织扩散到整个植株细胞中，激发植物产生系统性的抗病毒效应，从而使整个植株产生对同类病毒的抗性[4]。

值得注意的是，在长期竞争过程中，病毒也进化出了抵抗RNA沉默的机制。目前已经发现，在植物存在P1/HC-Pro、 P38、 2b、 βC1等RNA沉默抑制子，这些沉默抑制子可通过抑制包括sRNA生成在内的多个环节，来抑制宿主细胞中的RNA沉默系统，使病毒逃脱宿主的防御反应[5]。

2.2R基因介导的植物抗病毒机制 除了RNA沉默介导的抗病毒效应外，R基因(resistance genes)介导的抗病毒机制也是目前科学家最为关注的植物抗病毒机制。R基因可介导对包括病毒在内的多种病原体的抗性。当植物受到病原体侵染时，R基因直接或间接识别特定病原体的无毒基因，激活植物的防御反应，引发侵染点周围细胞的程序性死亡，导致周边细胞活性氧爆发、细胞壁加厚，使病毒被限制在损害的局部，不能扩散至周围健康组织。同时整株植物还通过一系列复杂的信号传导过程诱导出现非专一性抗多种病原体的系统性的获得性抗性(system acquired resistance)[6]。

3 抗病毒转基因番木瓜

3.1 RNA沉默是转基因植物抗病毒的分子机制 植物病毒给农业生产造成了极大困扰，对于植物病毒性疾病的防治一直是农业生产上关注的重要问题。由于化学药物无法抑制病毒在细胞中的复制增殖，植物病毒性疾病难以用药物防治。传统上，筛选和培育抗性品种是防治植物病虫害的有效方法之一，因为一些作物的某些品种或其野生种可能具有抗虫抗病基因，将普通栽培品种与它们进行杂交，就有可能获得抗性基因。然而并不是对于每一种病害，都能在自然界找到抗性品种作为育种材料。即便能找到抗性材料，要育成一个抗性品种也需要进行大量的筛选等育种工作，非常耗时耗力。特别是对于病毒来说，由于其变异速度很快，容易通过变异产生对抗宿主抗病毒基因的新毒株，使育种成果前功尽弃。相对而言，通过转基因的办法来培育抗病毒品种是比较有效的方法。由于病毒RNA沉默现象的存在，理论上只要给植物转入一个病毒的基因或其部分片段，植物就会产生对该病毒甚至同类其他病毒的抗性，通过选育就可以获得具有商业价值的抗病毒品种。转基因番木瓜(CaricapapayaL.)就是一个很成功的例子。

3.2 番木瓜环斑病毒是番木瓜生产的主要威胁 市场上作为水果销售的木瓜其实是番木瓜，原产地在南美，目前在我国南方地区普遍种植，主产地在广东、广西和海南。番木瓜是目前唯一在中国大陆种植的可食用转基因作物(目前在中国大陆种植的转基因作物共有3种，另2种是棉花和白杨)。番木瓜作为一种广受人们喜爱的水果，其生产却一直受到番木瓜环斑病毒(PRSV)的严重威胁。PRSV是单链正链RNA病毒，含有10 326个核苷酸，主要经蚜虫传播，能侵染多种葫芦科植物，分布于全世界，成为制约番木瓜产业发展的最主要的因素，严重时会导致番木瓜减产八九成。PRSV的综合防治措施包括采用无毒种子、隔离区或种植地尽量远离感染了病毒的地块、远离其他葫芦科植物、系统地除草以减少虫口、每两周一次拔除病株以及消灭蚜虫、将番木瓜种植在隔离室内以使带毒蚜虫不能到番木瓜上取食等。这些方法成本高、效果也不好。培育PRSV抗性品种是防治番木瓜环斑病最根本的方法，但番木瓜栽培品种中缺乏PRSV抗性资源，由于生殖隔离，野生番木瓜中的PRSV抗性基因又很难通过常规的杂交方法转移到番木瓜栽培品种中。

3.3 抗番木瓜环斑病毒的转基因番木瓜品种的制备 要想利用交叉保护作为防治PRSV的重要措施之一，就必须通过接种弱毒株，使番木瓜获得对强毒株的抗性，从而获得保护。但对于大规模种植来说，要在短时间内逐株接种是一个难以完成的任务。采用转基因的方法培育抗毒品种显然是一个最现实的办法。由于PRSV曾对夏威夷岛上的番木瓜产业造成了毁灭性打击，美国夏威夷大学和康奈尔大学于1986年开始致力于抗PRSV转基因番木瓜的研究。由于最初认为这种抗性是病毒外壳蛋白诱发的，他们首先就将PRSV毒株HA5-1的外壳蛋白(coat protein， CP)基因通过基因枪法导入番木瓜愈伤组织内，于1990年获得了世界上首例转PRSV-CP基因的番木瓜，并在1998年4月获得了商业化种植转基因木瓜的许可(商品名“SunUp”和“Rainbow”)。抗PRSV的转基因番木瓜的培育成功，拯救了夏威夷的番木瓜产业[7]。

但美国开发出的“SunUp”和“Rainbow”两个优良抗PRSV番木瓜品种，其主要针对的是夏威夷地区的HA病毒株系，对我国华南地区4个主要番木瓜环斑病毒株系Ys(优势株系)、Vb、Sm和Lc，以及我国台湾YK株系和泰国等亚洲国家的番木瓜环斑病毒株系不具有抗性。因此，不同国家开始选用当地优势病毒株系的基因进行番木瓜转基因研究，以期获得具有良好当地适应性的转基因品系。此外，由于PRSV是经由蚜虫传播的，而蚜虫可传播多种植物病毒，出于对潜在风险的考虑，人们也担心导入植物的PRSV-CP基因的表达产物可能与其他病毒基因组装导致新病毒的产生。

RNA干扰现象的发现，使科学家认识到这种由病毒诱导的抗性主要是通过RNA介导的转录后基因沉默实现的，而并不是由病毒的外壳蛋白诱导的。因此，理论上只要将PRSV的基因或部分片段导入到番木瓜细胞中，这些基因或片段在细胞核内转录出的mRNA进入到细胞质中后，将与入侵的PRSV核酸进行特异性的结合并使其降解，从而获得保护。

于是华南农业大学的科研人员通过农杆菌转化法，将我国华南地区PRSV的优势株系Ys的复制酶基因转入番木瓜植株，培育成功了我国首例获得商业化生产许可(2006年)的转基因番木瓜“华农一号”，目前已在华南地区广泛种植，该品种抗性广，对我们华南地区流行的各种番木瓜环斑病毒毒株都具有很好的抗性，深受瓜农喜爱，产生了良好的经济、社会和环境效益[8]。

从食品安全性的角度来看，转基因番木瓜与普通番木瓜没有任何不同。大量观察表明，转基因番木瓜的病毒蛋白对人体不存在有毒或过敏问题。实际上，在人们的日常生活中，经常食用感染了病毒的水果和蔬菜，只是没有意识到而已，但并没有出现由植物病毒成分引起的不良反应。自植物病毒发现以来，至今还没有发现植物病毒可以侵染人类的案例。我国对转基因番木瓜的食用安全性、过敏原性也进行了长期跟踪研究，没有发现任何安全问题。事实上，由于转基因抗病毒的机制是利用了RNA介导的转录后基因沉默现象，与自然界中感染病毒的植物相比，转基因抗性植物几乎不产生病毒蛋白或者可能产生极低浓度的病毒蛋白。而且，由于转基因番木瓜的抗性，还可以大大减少杀虫剂的使用，减轻农药残留的问题。