林艳 林倩 刘婷莉 马玉华 何春容 梁树梅 周明莉

摘要：目的  探討重组人IL-12（rIL-12）对乳腺癌细胞自噬的影响。方法  两株乳腺癌细胞（MDA-MB-231和MCF7）分别用rIL-12处理，经免疫蛋白印迹技术和细胞免疫荧光技术检测其自噬微管相关蛋白轻链3（LC3）的变化，以观察自噬情况;另外，用透射电镜观察rIL-12处理乳腺癌细胞前后自噬小体的变化。分别用胰岛素样生长因子1（IGF-1）激活磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）通路，再加入rIL-12处理后，蛋白免疫印迹法检测相关通路蛋白PI3K/Akt， 哺乳动物雷帕霉素靶点（TOR）磷酸化变化及LC3的表达。结果  与空白组相比，rIL-12组细胞的自噬标志蛋白LC3表达增高，差异有统计学意义（P<0.05），且增加程度呈时间和浓度依赖性;荧光显微镜观察自噬体形成的结果显示，与空白组相比，rIL-12处理组的细胞核周点状聚集的绿色荧光增多;使用电镜观察到rIL-12处理组明显有自噬小体形成。与rIL-12组相比，IGF-1+rIL-12组的LC3Ⅱ表达减少，差异有统计学意义（P<0.05）。结论  rIL-12可以激活乳腺癌细胞自噬，并通过抑制PI3K/Akt信号通路的机制，促进自噬标志蛋白LC3，特别是LC3Ⅱ的表达。

关键词：自噬;乳腺肿瘤;重组人IL-12;PI3K/Akt通路

中图分类号：R737.9                                 文献标识码：A                                 DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.23.018

文章编号：1006-1959（2019）23-0064-06

Study on Autophagy of Human Breast Cancer Cells by Recombinant IL-12

LIN Yan，LIN Qian，LIU Ting-li，MA Yu-hua，HE Chun-rong，LIANG Shu-mei，ZHOU Ming-li

（Department of Clinical Medical Laboratory，Chengdu Third People's Hospital，Chengdu 610031，Sichuan，China）

Abstract：Objective  To investigate the effect of recombinant human IL-12 （rIL-12） on breast cancer cell autophagy. Methods  Two breast cancer cells （MDA-MB-231 and MCF7） were treated with rIL-12， and the changes of autophagy microtubule-associated protein light chain 3 （LC3） were detected by immunoblotting and cell immunofluorescence. Observe autophagy; in addition， observe the change of autophagosomes in breast cancer cells before and after treatment with rIL-12 using transmission electron microscopy. Insulin-like growth factor 1 （IGF-1） was used to activate the phosphatidylinositol-3 kinase / protein kinase B （PI3K / Akt） pathway， and then treated with rIL-12. Western blot was used to detect the related pathway protein PI3K / Akt ， Mammalian rapamycin target （TOR） phosphorylation changes and LC3 expression. Results  Compared with the blank group， the expression of autophagy marker protein LC3 in the cells of the rIL-12 group was significantly increased， the difference was statistically significant （P<0.05）， and the degree of increase was time- and concentration-dependent; The results showed that， compared with the blank group， the green fluorescence around the nucleus in the rIL-12 treated group was significantly increased; it was observed that the autophagic bodies were formed in the rIL-12 treated group. Compared with rIL-12 group， the expression of LC3Ⅱ in IGF-1 + rIL-12 group was significantly reduced，the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion  rIL-12 can activate the autophagy of breast cancer cells， and promote the expression of autophagy marker protein LC3， especially LC3Ⅱ through the mechanism of inhibiting PI3K / Akt signaling pathway.

Key words：Autophagy;Breast tumor;Recombinant human IL-12;PI3K/ Akt pathway

乳腺癌（breast carcinoma）是导致世界女性因癌症死亡的重要原因[1]。在乳腺癌患者中，近50%的病例和60%的死亡率发生在发展中国家[2]。自噬是一种通过溶酶体来降解受损细胞器以及错误折叠的蛋白质的自我消化机制[3]，在合成、降解和大分子与细胞器的循环之间保持平衡。自噬被认为具有抑制肿瘤和促进肿瘤生长的功能[4，5]，这可能和不同的肿瘤类型和发展阶段有关[6，7]。在对乳腺癌细胞的研究中发现，自噬能够抑制肿瘤的发生，自噬标记基因 beclin 1的过表达会抑制乳腺癌细胞的生长[8]，40%～75%的人乳腺癌细胞、卵巢癌和前列腺癌细胞存在beclin 1缺陷[9，10]。在体内外实验中，beclin 1能够抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤形成[11]，许多抗癌药物，包括他莫西芬、雷帕霉素、三氧化二砷和组蛋白去乙酰化酶抑制剂会导致细胞因自噬而死亡。因此，激活自噬可能是抑制乳腺癌细胞发生的重要方式。先前研究已经证实了IL-12的抗肿瘤效应[12]。IL-12 通过活化大量T细胞、巨噬细胞、树突细胞来抑制肿瘤细胞生长[13]，通过抑制血管的生长来减少营养和氧的供给，从而抑制肿瘤细胞生长[14]，能够刺激或抑制肿瘤细胞分泌肿瘤相关细胞因子。有研究表明IL-12能够通过上调巨噬细胞集落刺激因子1受体的表达和磷酸化诱导单细胞肿瘤细胞向巨噬细胞样细胞极化[15]。然而，IL-12的抗肿瘤作用机制仍有待阐明。此外，IL-12对肿瘤细胞自噬的影响及其机制的报道较少。本文探讨了IL-12诱导人乳腺癌细胞自噬的可能信号通路，旨在为IL-12介导的抗肿瘤作用机制提供新的参考。

1材料与方法

1.1细胞及试剂  人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MCF-7细胞来源于ATCC;DMEM高糖培养基购自美国Hyclone公司;胎牛血清购自杭州四季青公司;人重组IL-12购自美国peprotech公司;重组人IGF-1细胞因子购自美国R&D公司;兔抗人LC3A/B抗体购自美国NOVUS公司;兔抗人p-Akt（473）/Akt抗体和兔抗人p-mTOR /mTOR均购自美国CST公司;兔抗人多克隆β-actin抗体购自美国Immunoway公司;辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP） 标記的羊抗兔 IgG（二抗）和FITC标记的羊抗兔二抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司;SDS-PAGE及免疫荧光相关试剂购自上海碧云天生物技术有限公司;化学发光试剂购自德国Merck Millipore 公司;荧光显微镜来自日本Nikon Corporation。

1.2细胞培养  乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7细胞均分别用含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培养液培养，含100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素。当细胞融合率约80%时， 用0.25%胰酶消化并传代，置于37℃、CO2体积分数为5%的细胞培养  箱中培养。将MDA-MB-231和MCF-7细胞（约1×106/孔）接种于6孔板，待其在6孔板中长到约60%融合时，开始实验处理。

1.3实验处理分组  ①将MDA-MB-231和MCF-7细胞分为空白组（B）、rIL-12组（1、2、3、5、12）、阳性对照组（P），其中rIL-12组，分别用5 ng/ml的rIL-12培养1， 2， 3， 6， 12 和 24 h。另外另将细胞分    为空白组（B）、rIL-12组分别用0.1， 0.5， 1， 5， 10 和 20 ng/ml的rIL-12培养乳腺癌细胞12 h，Western blot检测细胞内LC3蛋白，特别是LC3Ⅱ的表达情况。②将细胞分为空白组，rIL-12组和阳性对照组，rIL-12组用5 ng/ml的rIL-12培养人乳腺癌细胞24 h后，在荧光显微镜下观察细胞LC3的表达情况。③将细胞分为空白组，rIL-12组，rIL-12组用  5 ng/ml的rIL-12 培养乳腺癌细胞12 h，用透射电子显微镜观察空白组和rIL-12自噬小体。④Akt通路实验：包括rIL-12+IGF-1组和IL-12 组。rIL-12+IGF-1组：先用 100 ng/ml的IGF-1 培养 2 h，再加入 5 ng/ml的rIL-12 培养 4 h。IL-12 组：5 ng/ml的rIL-12培养4 h。⑤本实验所有的空白组（图中分组表示为B）为10%胎牛血清培养基，阳性对照组（图中分组表示为P）为含1%胎牛血清的DMEM高糖培养基饥饿3 h 。

1.4蛋白免疫印迹分析  实验完成后，收集6孔板中MDA-MB-231和MCF-7细胞，提取总蛋白，经SDS-PAGE分离蛋白后，湿转至0.45 μm 的PVDF膜，5%小牛血清封闭1 h，分别加入一抗，LC3，p-mTOR/mTOR，p-Akt（473）/Akt抗体的稀释比例均为1∶1000;β-actin的稀释比例为1∶2000），4℃过夜;用TBST洗膜，加入二抗（稀释比例为1∶1000），37℃反应2 h;用TBST洗膜后按照电化学发光试剂盒说明进行显影。采用Quantity One 4.5.2软件对各组电泳条带进行灰度值分析，以其与内参β-actin条带灰度值的比值来评估各相关分子的蛋白相对表达水平。

1.5免疫荧光  在24孔培养板中置入8×8 mm的灭菌爬片，再加入MDA-MB-231和 MCF-7 两株乳腺癌细胞悬液（约2×105/孔），当其生长约60%融合时，开始实验组处理。实验处理完毕后用预冷的PBS洗3次，用4%的多聚甲醛室温固定20 min后再次用预冷PBS洗3次。爬片用0.1%的Triton透膜15 min后，预冷PBS洗3次。10%山羊血清（PBS稀释）室温封闭30min。之后加入LC3一抗4℃ 孵育过夜（LC3一抗用10% 山羊血清1∶200稀释），洗涤后用FITC标记的羊抗兔二抗（山羊血清1∶200稀释）室温避光孵育2 h。再次洗涤后，用10% 用PBS稀释的4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）室温孵育5 min，洗涤3次后用甘油封片4℃避光保存，在荧光显微镜野下（×800）观察LC3绿色荧光点表达。

1.6透射电子显微镜  MDA-MB-231和MCF-7 两株乳腺癌细胞用浓度为rIL-12（5 ng/ml）的10%胎牛血清的DMEM高糖完全培养液培养12 h后用预冷PBS洗3次，用0.1%胰蛋白酶消化收集细胞，用4℃离心机1，500 xg 离心10 min，弃去微量离心管上清液，沿管壁加入1.5 ml的2.5% 戊二醛放于4℃固定至少2 h。及时送重庆医科大学生命科学院电镜室进行制样和拍片（×30000）。

1.7统计学方法  应用SPSS 19.0软件对各实验结果数据进行统计学分析，各实验均独立重复3次统计结果，数据以（x±s）表示，多组间差异采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 Western blot检测rIL-12与人乳腺癌细胞中LC3蛋白的表达关系  Western blot结果显示，rIL-12能够增加人乳腺癌细胞中LC3蛋白表达，经rIL-12组的乳腺癌细胞相对空白组中的自噬标记蛋白LC3表达增加，特别是LC3Ⅱ的表达，且呈时间和剂量的依赖性，见图1A、1B。

2.2 免疫荧光检测rIL-12与人乳腺癌细胞中LC3蛋白表达关系  免疫荧光结果显示，rIL-12能够增加人乳腺癌细胞中LC3蛋白表达与空白组相比，阳性对照组和rIL-12组LC3Ⅱ蛋白的表达增加，在显微镜下表现，rIL-12组的细胞核周围聚集的颗粒状绿色荧光增加，见图2。

2.3 rIL-12与乳腺癌细胞自噬小体形成的关系  透射电子显微镜结果显示，rIL-12能够增加人乳腺癌细胞自噬小体形成，经rIL-12处理后的乳腺癌细胞中发现许多自噬小体（黑色箭头），空白对照组乳腺癌细胞不易找到自噬小体，见图3。

2.4 rIL-12通过抑制Akt通路诱导乳腺癌细胞自噬 Western blot和免疫荧光结果显示，与rIL-12组相比，IGF-1+rIL-12组的p-PI3K/Akt增加，p-mTOR表达也增加， LC3Ⅱ表达明显减少，见图4、图5。说明Akt的活化能够抑制rIL-12诱导乳腺癌细胞   p-mTOR，从而抑制LC3特别是LC3Ⅱ表达的能力，提示rIL-12能通过抑制PI3K/Akt来抑制下游的mTOR磷酸化来诱导乳腺癌细胞的自噬。

（29）：3303-3308.

[15]Ma TT，Wu BT，Lin Y，et al.IL-12 could induce monocytic tumor cells directional differentiation[J].Mol Cell Biochem，2015（402）：157-169.

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收稿日期：2019-9-2;修回日期：2019-9-14

編辑/肖婷婷