马晓云 田琳琳 李代清 汤云昭

摘要：目的  探究生物钟节律紊乱对糖尿病肥胖小鼠（ob/ob）糖代谢及胰岛素分泌的影响。方法  选取同体重的6～8周龄C57BL/6及ob/ob小鼠各12只，随机分为对照组（C57组）、糖尿病组（OB组）、对照组+生物钟节律干扰组（C57+CSD组）、糖尿病组+生物钟节律干扰组（OB+CSD组），每组6只。C57+CSD组和OB+CSD组小鼠分别置于高台水环境下干扰其生物钟节律。C57组和OB组小鼠分别置于标准饲养笼中，其生物钟节律不受干扰，动物体重每天监测1次。4周后行小鼠体内腹腔注射葡萄糖耐量实验（IPGTT，2 g/kg），分离实验小鼠胰岛行体外葡萄糖刺激胰岛素分泌实验（GSIS）。结果  C57、C57+CSD和OB组体重分别增长22.92%、0.42%和26.16%，而OB+CSD组下降0.17%。空腹血糖測定显示：OB组与OB+CSD组血糖值水平高于C57组和C57+CSD组（P<0.05）;IPGTT实验显示：OB组小鼠血糖峰值明显后移，且在15、30、60、90 min的血糖均高于C57组（P<0.05）;C57+CSD组小鼠各时间点血糖均高于C57组（P<0.05），OB+CSD组小鼠于120 min的血糖高于OB组（P<0.05）;体内、体外胰岛素测定显示：C57胰岛素分泌低于OB组（P<0.05），C57+CSD组胰岛素分泌低于C57组（P<0.05），OB+CSD组血清及体外胰岛胰岛素分泌低于OB组（P<0.05）。结论  生物钟节律是维护糖代谢稳态的重要环节，其紊乱可能导致正常及糖尿病小鼠胰岛素分泌的减低。

关键词：生物钟节律;糖尿病;血糖;胰岛素分泌

中图分类号：R587.1                                文献标识码：A                                  DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.23.017

文章编号：1006-1959（2019）23-0061-04

Experimental Study on the Effects of Biological Clock Rhythm Disorder on Glucose Metabolism and Insulin Secretion in Diabetic Mellitus Mice

MA Xiao-yun，TIAN Lin-lin，LI Dai-qing，TANG Yun-zhao

（Tianjin Key Laboratory of Metabolic Diseases/National Health and Safety Commission Key Laboratory of Hormone and Development/Tianjin Medical University Zhu Xianyi Memorial Hospital/Tianjin Medical University，Tianjin 300134，China）

Abstract：Objective  To investigate the effects of biological clock rhythm disorder on glucose metabolism and insulin secretion in diabetic mellitus obese mice （ob/ob）. Methods  12 C57BL/6 and ob/ob mice， aged 6-8 weeks， were randomly divided into control group （C57 group）， diabetic mellitus group （OB group）， control group + biological clock rhythm interference group （C57+）. CSD group）， diabetes mellitus group + biological clock rhythm interference group （OB+CSD group）， 6 in each group. The C57+CSD group and the OB+CSD group were each placed in a high-level water environment to interfere with their biological clock rhythm. C57 and OB mice were placed in standard cages， respectively， and their clock rhythms were undisturbed. Animal weight was monitored once a day. After 4 weeks， the mice were intraperitoneally injected with glucose tolerance test （IPGTT， 2g/kg）， and the islet glucose-stimulated insulin secretion test （GSIS） was isolated from the mice. Results  The body weight of C57， C57+CSD and OB groups increased by 22.92%， 0.42% and 26.16%， respectively， while the OB+CSD group decreased by 0.17%. Fasting blood glucose measurement showed that the blood glucose level of OB group and OB+CSD group was higher than that of C57 group or C57+CSD group （P<0.05）. The IPGTT experiment showed that the blood glucose peak of OB group was significantly shifted back，the blood glucose at 15， 30， 60， 90 min was higher than that in C57 group （P<0.05）. The blood glucose in C57+CSD group was higher than that in C57 group （P<0.05）. OB+CSD mice The blood glucose at 120 min was higher than that in OB group （P<0.05）. In vivo and in vitro insulin assay showed that C57 insulin secretion was lower than that of OB group （P<0.05）， and insulin secretion in C57+CSD group was lower than that of C57 group （P<0.05）. The serum and in vitro insulin secretion of OB+CSD group was lower than that of OB group （P<0.05）. Conclusion  The biological clock rhythm is an important link to maintain the homeostasis of glucose metabolism， and its disorder may lead to a decrease in insulin secretion in normal and diabetic mellitus mice.

Key words：Biological clock rhythm;Diabetes mellitus;Blood sugar;Insulin secretion

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是由多种环境因素和多基因遗传因素共同参与并相互作用引起的一组代谢异常综合征，临床上以长期高血糖为主要特征[1]。随着社会经济的发展，城市化生活的普及，老龄化进程的加快，2型糖尿病（T2DM）患者数量迅速增加[2]。我国现有糖尿病人数高达1亿，且患病人数正不断攀升，患病人群呈年轻化趋势[3]。2型糖尿病發病的两个基本环节是β细胞功能缺陷以及胰岛素抵抗，但引起两个基本病理生理改变的机制尚不明确。流行病学证据表明，多种代谢性疾病的发生都与生物钟的昼夜节律紊乱相关[4]，其中2型糖尿病尤为明显。有研究显示[5]，睡眠不当、轮班工作等昼夜节律改变者发生糖尿病、肥胖以及心血管疾病的风险增加。同时糖尿病的许多并发症，包括急性冠脉综合征、脂代谢紊乱及自主神经功能失调等均体现出明显的昼夜节律改变，另外昼夜节律的紊乱与糖尿病的血糖控制密切相关[6]。进化论观点认为，人类在长期的进化过程中，体内早已形成了复杂而精确的昼夜节律调控网络，但工作时间延长、夜班工作及睡眠不足等现代的生活方式以不同的方式对这一网络产生影响，必定会影响代谢功能[7]。因此探究昼夜节律和糖代谢之间的相关性，对于2型糖尿病的治疗和控制具有深远意义。本研究借助OB/OB小鼠糖尿病动物模型，检测生物钟节律紊乱对糖尿病小鼠血糖控制及胰岛素分泌的影响。

1材料与方法

1.1材料  C57BL/6J小鼠和OB/OB小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司。胶原酶购自Sigma公司，TRIzol购自赛默飞世尔科技公司，Hanks液购自上海化工生物有限公司，胰岛素ELISA试剂盒购自Media公司，电子天平购自北京Sartorius公司，各规格细胞培养板和离心管购自美国Corning公司，各规格移液器和枪头购自赛默飞世尔科技公司，ACCU-CHEK  Performa卓越型血糖仪购自德国罗氏公司，LEICA L2型体视显微镜购自德国Leica公司，微波炉购自格兰仕微波炉电器有限公司，酶联免疫检测仪购自美国Bio-Rad 公司。

1.2方法

1.2.1分组及处理  选取同体重6～8周龄的健康、雄性SPF级C57BL/6及ob/ob小鼠，各12只，随机分为空白对照组（C57组）、糖尿病模型组（OB组）、空白睡眠节律干扰组（C57+CSD组）、模型睡眠节律干扰组（OB+CSD组），每组6只。采用改良多平台水环境法，其中C57+CSD组和OB+CSD组小鼠分别置于含水的睡眠剥夺笼（笼内圆形平台直径3 cm，高5.0 cm），小鼠放于笼内平台之上，小鼠入睡时因肌肉松弛掉入平台外的水中，干扰其正常睡眠节律。干预时间为每天早7∶00至晚19∶00，共12 h，余时间置于正常笼中。正式实验干扰时间为4周，实验开始前连续3 d，将小鼠放置于实验条件下适应1 h。C57组和OB组小鼠置于正常笼中，实验环境与睡眠节律干扰组相同。

1.2.2小鼠体重称量  每日观察小鼠一般状况。每周于固定时间点用电子天平称量小鼠体重并记录。

1.2.3腹腔葡萄糖耐量实验  实验期限结束后，各实验组小鼠禁食12 h，按照2 g/kg的剂量向小验鼠腹腔注射葡萄糖，分别于0、15、30、60、120 min测定并记录血糖值。

1.2.4 ELISA法测定血清胰岛素含量  向胰岛素ELISA试剂板内依次加入10 μl的血清样品与标准品，然后向各检测孔加100 μl的抗体的稀释液，室温孵育2 h;弃去板内液体，各孔内加入350 μl洗涤液，反复清洗5次;向各检测孔加入200 μl显色液，室温避光静置20 min;每孔依次加入50 μl终止液，振荡5 s，酶标仪下测定OD450处吸光度值并绘制标准曲线，计算血清中胰岛素浓度。

1.2.5小鼠胰岛的分离  小鼠禁食12 h后，用40 g/L的水合氯醛腹腔注射麻醉，仰卧位固定于操作台上，75%的酒精消毒胸腹部皮肤，沿腹正中线打开腹腔。结扎胰腺导管口十二指肠端，破心处死小鼠，用头皮针于近肝门处穿刺胆总管，随后向胰腺内灌注1 g/L胶原酶3～5 ml，待胰腺完全膨胀后，快速剪下胰腺组织放在离心管内，剪去多余脂肪组织和周围血管，37℃水浴15～20 min。随后向离心管内加入4℃预冷的Hanks液40 ml，终止消化。快速晃动离心管至胰腺呈泥沙状，冰浴10 min，吸弃约30 ml的上层液体，再次加入4℃预冷的Hanks液，洗涤5次。体视镜下挑选形态光滑的胰岛以备用。

1.2.6葡萄糖刺激离体胰岛胰岛素分泌实验  取大小形态相近的新鲜圆形胰岛，培养于12孔板，置于37℃培养箱培养过夜，将胰岛按实验分组每孔5个移至96孔板，分别用2.5 mmol/L低糖孵育液和   25 mmol/L高糖培养液，于37℃细胞培养箱孵育胰岛1 h，收集各孔低糖（或高糖）培养液至EP管中，于4℃预冷高速离心机3000 rpm离心10 min，收集500 μl上层上清液至新的EP管中，参照胰岛素ELISA试剂盒说明书检测上清液胰岛素分泌水平。

1.3统计学分析  采用SPSS 20.0对结果进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1生物钟节律紊乱对小鼠体重的影响  生物钟节律紊乱4周后，C57组小鼠体重增加22.92%，C57+CSD组小鼠体重增加0.42%;而OB组小鼠体重增加26.16%，OB+CSD组小鼠体重减低0.17%。C57+CSD组、OB组、OB+CSD组小鼠体重增加均减少，而OB+CSD组体重下降更明显（P<0.05），见图1。

2.2生物鐘节律紊乱对小鼠糖耐量的影响  IPGTT结果显示，C57组小鼠各时间点血糖均在正常范围内;与C57组相比，C57+CSD组小鼠在30 min时间点血糖值明显升高（P<0.05）;OB组小鼠较C57组小鼠血糖峰值后移，且在15、30、60、90、120 min时间点血糖均升高（P<0.05）;与OB组比较，OB+CSD组小鼠在15、30、60、90、120 min时间点血糖明显升高，见图2。

2.3生物钟节律紊乱对小鼠空腹血清胰岛素分泌的影响  空腹血清胰岛素值结果显示，C57组与C57+CSD组小鼠空腹胰岛素水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）;OB组与OB+CSD组小鼠空腹胰岛素水平比较，差异无统计学意义（P>0.05），见图3。

2.4生物钟节律紊乱对离体胰岛葡萄糖刺激胰岛素分泌的影响  离体胰岛分别经2.5 mmol/L低糖、   25 mmol/L高糖培养基刺激后，上清液胰岛素检测结果显示：经低糖或高糖刺激后：OB组与OB+CSD组胰岛素分泌水平高于C57组或C57+CSD组，差异有统计学意义（P<0.05）;经高糖刺激后：与C57组相比，C57+CSD组离体胰岛胰岛素分泌减低，差异有统计学意义（P<0.05）;经高糖刺激后：与OB组相比，OB+CSD组离体胰岛胰岛素分泌减低，差异有统计学意义（P<0.05），见图4。

3讨论

随着全球经济的快速发展，生活节奏的加快，越来越多的人出现睡眠不足、睡眠质量下降等睡眠问题[8]。研究表明，不规律的生活方式，如睡眠不当、轮班工作等可使昼夜节律改变，进而导致2型糖尿病、肥胖和代谢障碍等疾病的发生[9，10]。持续性高血糖及胰岛素绝对或相对缺乏为2型糖尿病的主要特    征[11]，其中胰岛素分泌在白天分泌较多，而在夜间相对减低，由昼夜节律系统调节[12]，在整个“睡眠-觉醒”周期中葡萄糖耐量和胰岛素分泌具有内在节律性[13]。研究表明，昼夜节律时钟基因在胰岛素分泌以及糖代谢过程中发挥重要作用，内源性昼夜节律的紊乱可能导致2型糖尿病的发生[14]。

为探究生物钟节律紊乱在糖代谢中的作用，本研究通过经典水平台法构建小鼠睡眠节律紊  乱模型，旨在探讨睡眠节律紊乱对正常及糖尿病 小鼠糖代谢以及胰岛功能的影响。本研究中所用到的OB/OB小鼠发生了瘦素基因（ob）纯合突变，表现为肥胖、多食、高血糖、胰岛素抵抗等，被推荐作为研究2型糖尿病的良好动物模型[15]。本研究中用C57BL/6小鼠作为OB/OB糖尿病小鼠的对照组。从体重结果可以看出，C57组与OB组小鼠体重明显增加，C57+CSD组体重增加并不明显，而OB+CSD组体重则减低。说明睡眠紊乱可导致体重的减低，导致体重减低的原因之一可能是睡眠限制 增加了大鼠的能量消耗。与睡眠状态相比，醒着的状态会导致更多的能量消耗以及交感神经自主神经活动增加[16-18]。另一方面，可能是睡眠剥夺小鼠在实验过程中承受更多的压力反应，有研究表明，  睡眠限制可引起压力应激进而导致体重减 轻[19，20]。OB组与OB+CSD组血糖值含量明显高于C57组或C57+CSD组，但是在空腹状态下，CSD并没导致血糖的升高。与之相反的结果体现在IPGTT实验，高糖刺激之下，C57+CSD组血糖在30min时明显高于对照组，OB+CSD组在30、60、90、120 min血糖均高于其OB对照组，表明睡眠剥夺导致的生物节律紊乱造成了大鼠糖代谢的紊乱。胰岛素测定与血糖紊乱相呼应，空腹状态下，C57组与C57+CSD组胰岛素水平比较，OB组与OB+CDS组胰岛素水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05），但是在离体胰岛高糖刺激实验中，C57及ob/ob小鼠经睡眠紊乱剥夺后，胰岛分泌均被抑制，分泌值较对照组明显下降。

综上所述，胰岛素分泌与生物钟节律存在着 密切的关系，是维持血糖的生理稳态的关键因素 之一。当正常的生物钟节律破坏后，胰岛分泌功能受限导致糖代谢紊乱，其中的分子机制需要进一步探索。

参考文献：

[1]Aldawi N，Darwiche G，Abusnana S，et al.Initial increase in glucose variability during Ramadan fasting in non-insulin-treated patients with diabetes type 2 using continuous glucose monitoring[J].Libyan J Med，2019，14（1）：1535747.

[2]Gonzalez L，Garrie K，Turner M.Type 2 diabetes-An autoinflammatory disease driven by metabolic stress[J].Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis，2018，1864（11）：3805-3823.

[3]Wang LM，Gao P，Zhang M，et al.Prevalence and Ethnic Pattern of Diabetes and Prediabetes in China in 2013[J].Jama-Journal of the American Medical Association，2017，317（24）：2515-2523.

[4]Wu T，ZhuGe F，Sun L，et al.Enhanced effect of daytime restricted feeding on the circadian rhythm of streptozotocin-induced type 2 diabetic rats [J].Am J Physiol Endocrinol Metab，2012，302（9）：E1027-1035.

[5]Tang Y，Meng L，Li D，et al.Interaction of sleep quality and sleep duration on glycemic control in patients with type 2 diabetes mellitus[J].Chin Med J（Engl），2014，127（20）：3543-3547.

[6]Leproult R，Holmback U，Van Canter E.Circadian Misalignment Augments Markers of Insulin Resistance and Inflammation，Independently of Sleep Loss[J].Diabetes，2014，63（6）：1860-1869.

[7]Asher G，Sassone-Corsi P.Time for Food：The Intimate Interplay between Nutrition，Metabolism， and the Circadian Clock [J].Cell，2015，161（1）：84-92.

[8]Li M，Li X，Lu Y.Obstructive Sleep Apnea Syndrome and Metabolic Diseases[J].Endocrinology，2018，159（7）：2670-2675.

[9]Hein M，Lanquart J，Loas G，et al.Prevalence and Risk Factors of Type 2 Diabetes in Major Depression：A Study on 703 Individuals Referred for Sleep Examinations[J].Psychosomatics，2018，59（2）：144-157.

[10]Paschos GK，FitzGerald GA.Circadian clocks and vascular function [J].Circ Res，2010，106（5）：833-841.

[11]Hida M，Anno T，Kawasaki F，et al.A rare case of large pyosalpinx in an elderly patient with well-controlled type 2 diabetes mellitus：a case report[J].J Med Case Rep，2018，12（1）：286.

[12]Bonnefond A，Froguel P.Disentangling the Role of Melatonin and its Receptor MTNR1B in Type 2 Diabetes：Still a Long Way to Go[J].Curr Diab Rep，2017，17（12）：122.

[13]Kent B，McNicholas W，Ryan S.Insulin resistance，glucose intolerance and diabetes mellitus in obstructive sleep apnoea[J].J Thorac Dis，2015，7（8）：1343-1357.

[14]Forrestel A，Miedlich S，Yurcheshen M，et al.Chronomedicine and type 2 diabetes：shining some light on melatonin[J].Diabetologia，2017，60（5）：808-822.

[15]Roh J，Lee J，Park S，et al.CRISPR-Cas9-mediated generation of obese and diabetic mouse models[J].Exp Nim，2018，67（2）：229-237.

[16]Barf RP，Van Dijk G，Scheurink AJW，et al.Metabolic consequences of chronic sleep restriction in rats：Changes in body weight regulation and energy expenditure[J].Physiology&Behavior，2012，107（3）：322-328.

[17]Jung CM，Melanson EL，Frydendall EJ，et al.Energy expenditure during sleep，sleep deprivation and sleep following sleep deprivation in adult humans[J].Journal of Physiology-London，2011，589（1）：235-244.

[18]Sgoifo A，Buwalda B，Roos M，et al.Effects of sleep deprivation on cardiac autonomic and pituitary-adrenocortical stress reactivity in rats[J].Psychoneuroendocrinology，2006，31（2）： 197-208.

[19]Pardon MC，Marsden CA.The long-term impact of stress on brain function：From adaptation to mental diseases[J].Neuroscience and Biobehavioral Reviews，2008，32（6）：1071-1072.

[20]De Kloet ER，Joels M，Holsboer F.Stress and the brain：From adaptation to disease[J].Nature Reviews Neuroscience，2005，6（6）：463-475.

收稿日期：2019-9-19;修回日期：2019-9-30

編辑/肖婷婷