李俊霞 蔺晓月 孙圣福 陈静 田夫林 李云岗 张月

（山东省动物疫病预防与控制中心 250031）

乳酸菌是一种革兰氏阳性菌，可以发酵碳水化合物生成大量的乳酸，具有双歧杆菌、乳酸杆菌、乳酸球菌等十几个属。在人体、大部分动物肠道中，乳酸菌是非常常见的一种细菌。乳酸菌没有致病性，被应用于食品工业等领域中，是一种公认的安全级微生物。双歧菌属、肠球菌属、乳球菌属、乳杆菌属等因与益生作用具有密切关系，受到人们的广泛重视。乳酸菌可在黏膜部位、生殖系统、泌尿、胃肠道等中黏附存活，并且没有病原性，利用乳酸菌的这一特点进行了大量的活菌口服疫苗研究，并且受到广泛关注。

口服疫苗利用胃肠黏膜来递呈抗原，经过不同的免疫通路，能产生和常规注射相似的免疫反应。在医学、分子生物学快速发展的背景下，有关口服疫苗在黏膜抗原递呈的研究有了突破性的发展，可以诱导机体产生有效的免疫应答与免疫耐受。

1 乳酸菌表达系统的特点

近年来，在研究疫苗传递系统方面，研究人员迫切找到一种传递载体，可以在机体内长时间存在、不会对机体产生损害，并且可以产生持续免疫力。作为原核表达系统中的一种，在表达外源基因方面乳酸菌表达系统具有以下几个特点：（1）一些菌种自身携带大量染色体外因子，比较容易发展新的表达载体系统；（2）培养简便，遗传操作方法效率高、已经较为成熟，具有良好的重复率；（3）乳酸菌是食品级的细菌，能构建食品级的表达系统和基因克隆，促进基因工程相关产品安全性的提高；（4）本底表达水平比较低，表达量相对较高，纯化简单；（5）该系统的启动子系统能进行高度调控，且能表达毒素基因；（6）在细胞内、细胞外均能表达，并且可以分泌到细胞外；（7）乳酸菌无内毒素、比较安全，其表达的外源蛋白不用进行纯化便能和菌体一起服用；（8）乳杆菌等菌株对机体黏膜有非常强的黏附作用，乳酸菌表达与治疗或免疫作用的蛋白可以源源不断在黏膜处生产，持续向机体释放目的抗原蛋白，能有效引起机体的免疫应答和免疫耐受，提高对人、畜的免疫作用，是一种极具广泛应用前景的、理想的抗原呈递载体。

2 乳酸菌口服疫苗的作用机理

乳酸菌口服疫苗是以乳酸菌作为载体菌，利用基因工程技术重组病毒、细菌或寄生虫等病原基因，构建能表达外源抗原或携带外源DNA 疫苗的重组乳酸菌。这些重组菌能通过口服或滴鼻的途径将抗原传递至宿主黏膜系统，进而在黏膜水平刺激免疫宿主产生免疫反应。其可同时激发机体体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫应答，且免疫过程和病原感染一致，能在黏膜水平预防病原感染。重组乳酸菌不仅具有疾病预防作用，对已发生的病毒感染同时具有一定的治疗和抑制作用。下文主要阐述了乳酸菌在几种常见猪病预防中的研究和应用。

3 乳酸菌口服疫苗在猪病防治中的应用

3.1 猪流行性腹泻

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的猪的一种高度接触性肠道传染病，主要特征是引起猪的食欲不振、呕吐、腹泻，不同日龄的猪发病时的临床症状不尽相同，发病仔猪多数会因脱水导致死亡[1]。当前猪流行性腹泻发病率居高不下，临床症状也愈来愈复杂，时常出现混合感染的现象，给养猪产业带来严重危害，因而其疫苗的研制备受广大研究者重视。张月构建携带PEDV S 基因和复制子基因Rep.8014的 pRc/CMV2-S1-Rep.8014 和 pRc/CMV2-S2-Rep.8014 重组质粒，并将其转入乳酸菌中，得到重组乳酸杆菌疫苗。通过多组动物实验的口服免疫，发现重组乳酸杆菌口服疫苗不仅能激发小鼠的体液和细胞免疫，而且能刺激肠道局部免疫应答[2]。另外，有研究从健康猪体内分离筛选thyA 基因缺陷型乳酸杆菌，构建含有PEDV 主要保护性抗原基因的以thyA 基因为选择压力的非抗性乳酸杆菌表达载体，转入乳酸杆菌，制备基因工程乳酸杆菌口服疫苗[3]。

3.2 猪传染性胃肠炎

猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis of pigs，TGE）是一种急性、高接触性肠道传染病，由冠状病毒科冠状病毒属的猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of pigs，TGEV）引起，病猪临床症状为呕吐、严重腹泻、脱水，多与猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒和致病性大肠杆菌等病院混合感染，一般不易诊断鉴别[4]。各种年龄及品种的猪对TGEV 均容易感染，特别是2 周龄以下的仔猪感染后死亡率高达100%。猪传染性胃肠炎呈世界性分布，给各国养殖产业带来非常严重的经济损失。黄海楠等构建含TGEV S 基因AD 片段的载体，并转入乳酸杆菌中表达，制备乳酸菌口服疫苗，免疫小鼠，经细胞免疫和体液免疫检测，结果表明，这一乳酸杆菌口服疫苗具有比较好的免疫效果[5]。

3.3 猪轮状病毒病

猪轮状病毒（Porcine Rotavirus，PRV）是呼肠孤病毒科，轮状病毒属，是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原之一，该病在世界范围内分布，其感染引发的腹泻已发展成为一种世界性的疾病，给世界各地畜牧业造成严重的损失。1～4 周龄仔猪的发病率超过80%，死亡率可达20%。研究者们分别构建含有猪轮状病毒VP4、VP6、VP7 蛋白的重组乳酸菌，用其诱导小鼠产生明显的血清和黏膜抗体，从而促进小鼠细胞免疫和体液免疫[6-8]。

3.4 猪细小病毒病

猪细小病毒（Porcine Parvovirus，PPV）属于细小病毒科细小病毒属，临床症状主要是引起初孕母猪的繁殖障碍，导致仔猪皮肤炎症和肠炎性腹泻。这种疾病在临床表现和病理特点上不尽相同[9]。目前，PPV 与其他病毒混合感染发生较多，是导致很多疾病综合征的病原之一。徐义刚等构建的分泌型重组猪细小病毒VP2 基因的重组干酪乳杆菌免疫小鼠能产生明显的抗PPV 抗体水平，表明分泌型的重组乳酸菌作为口服疫苗载体具有更好的免疫原性[10]。另外，王相清等构建了重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB）和猪细小病毒VP2 蛋白的干酪乳杆菌细胞表面表达和分泌表达系统，其试验结果表明，VP2 蛋白和LTB 共表达时，可增强黏膜免疫反应，其中LTB 具有较好的免疫原性、抗原性和佐剂特性，这一研究为研制新型、有效的猪细小病毒口服疫苗奠定了基础[11]。

3.5 口蹄疫

口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV）引起的一种烈性、急性动物传染病，其临床症状表现为口腔黏膜、蹄部及乳房皮肤发生水疱和糜烂，具有很快的传播速度，并且影响范围较大，给畜牧养殖业带来非常大的经济损失[12]。随着畜牧业养殖规模化程度的提高，口蹄疫对畜牧养殖业的危害越来越大，其预防难度不断增大，传统预防措施已明显不足，这对新的防控技术，尤其是对安全有效的新型疫苗的需求日渐迫切。李云岗等构建FMDV VP1 乳酸杆菌口服疫苗，并用其免疫仔猪，检测结果显示，这一疫苗能产生比较高的抗体效价，能诱导体液免疫和细胞免疫[13]。王淼等构建的重组乳酸杆菌免疫豚鼠的结果也显示，乳酸菌口服疫苗可以增强动物的免疫功能，预防FMDV 的感染[14]。

3.6 猪链球菌病

猪链球菌（Streptococcus suis）根据菌体荚膜抗原特性的差别，可以分为35个血清型，其中猪链球菌2 型感染时，致病性较强，传播速度较快，并且其致死率较高[15]。猪链球菌病流行没有明显的季节性，一年四季均可发生，因此，为控制猪链球菌病的发生应以预防为主。张秋香等将猪链球菌毒力因子EF和MRP 基因连接在组成型启动子P59 和信号肽Usp45 下游，构建乳酸菌表达载体，使其在干酪乳杆菌中表达，制备口服疫苗[16]。用这种口服疫苗饲喂小鼠发现，这种重组乳杆菌可以刺激小鼠产生特异性抗体，这一研究为猪链球菌病乳酸菌口服疫苗的研制提供了实验基础。

4 乳酸菌口服疫苗的问题与展望

首先，乳酸菌作为口服疫苗载体虽然具有很多优点，但在乳酸菌疫苗市场化之前仍面临很多问题。目前可用于构建疫苗的载体菌株仅限于乳酸乳球菌和乳酸杆菌属中的几个菌株，表达的抗原蛋白仅限于几种，构建成功的疫苗也不多，开发更多、更有效的疫苗载体株，构建更多、更有效的疫苗是今后的一个研究方向。第二，对目前构建的疫苗效果的研究仅限于动物试验阶段和体外试验阶段，疫苗的临床应用还需一段时间。第三，口服免疫是益生菌疫苗的一个重要优势，这要求疫苗菌株要能经受人体胃肠道胃酸和胆盐的作用。而且，工程菌在体内可以存活多久及乳酸杆菌携带抗原表达的效果有待确定。另外，动物及人体肠道的微生态系统非常复杂，疫苗菌株与其他微生物间是否相互影响，这种影响是否会削弱疫苗的免疫效果是疫苗临床应用中应考虑的问题。