赵 君，张大伟，徐剑文，徐海江，刘剑光，朱家辉，吴巧娟，孔 杰，肖松华, 阿里普·艾尔西

(1.江苏省农业科学院经济作物研究所/农业部长江下游棉花和油菜重点实验室，江苏 南京 210014；2.新疆农业科学院经济作物研究所，新疆 乌鲁木齐 830091)

棉花是中国主要的经济作物，棉花生产在中国国民经济中占有举足轻重的地位。棉花的病害比较多，特别是黄萎病，给棉花生产造成巨大损失。棉花黄萎病是Carpenter于1914年在美国弗吉尼亚州发现并报道的，是世界范围内一种破坏性极大的土传性维管束真菌病害，主要由大丽轮枝菌引起[1]。中国棉花黄萎病是由于1935年引进美国斯字棉4B棉种传入中国的，之后随着棉种的繁殖和调运，棉花黄萎病在中国各主要产棉区逐渐传播开来。特别是近几年，新疆棉区的黄萎病发生逐年加重，严重影响中国棉花产业的发展。

棉花对黄萎病的抗病机制是一个非常复杂的过程，涉及多种物质和信号途径。研究结果表明，萜醛类化合物、苯丙素类化合物、活性氧、水杨酸、茉莉酸、乙烯、油菜素内酯，精胺和Camalexin等信号途径参与了棉花对黄萎病的抗性过程[2-7]。为探究植物对黄萎病的抗病机制，大量抗黄萎病相关的基因被克隆[8]。研究结果显示，一些外源基因也能提高棉花对黄萎病的抗性[9-13]。同时，许多学者也开展了抗黄萎病基因分子标记定位研究，取得了很大的进展。到目前为止，在棉花的26条染色体或连锁群上共检测到至少193个抗病相关QTL。部分研究者使用Meta-analysis方法，将已经发表的抗黄萎病相关QTL进行分析，至少筛选获得28个QTL簇，检测到13个抗黄萎病QTL热点区域，分布在9条染色体上(分别为染色体4、染色体5、染色体7、染色体8、染色体16、染色体19、染色体21、染色体23和染色体26[14])。

许多学者对不同棉种进行黄萎病抗性鉴定，认为多数海岛棉品种对黄萎病的抗性较强。近20年来，许多育种学家尝试通过回交将海岛棉抗黄萎病性状转育到陆地棉中，但是由于连锁累赘的影响，进展缓慢[14]。陆地棉是世界棉花的主要栽培种，但其遗传基础狭窄，缺乏对多种病虫害的抗性，仅有少数品种对黄萎病的抗性能达到耐病标准。到目前为止，国内外公开发放的抗源品种有常抗棉、文 5、豫棉 19、豫棉 21、94-56D、Acala 90、Delcot 344、Siokra15、中G4和中植棉2号等，对黄萎病具有较高的抗性[15-16]。利用分子生物学方法解析这些陆地棉的抗黄萎病机制，通过回交方法将抗病性状进行转育，能够显著加快育种进程。

在前期的研究工作中，从泗棉3号与中植棉2号杂交后代群体中，通过人工病圃定向筛选获得1个抗黄萎病新品系苏VR018。本研究利用苏VR018与泗棉3号构建F2群体，定位与抗病相关的QTL，获得与抗病连锁的分子标记，为中植棉2号抗黄萎病基因的精细定位和抗黄萎病性状的育种利用奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

2012年，本研究室利用感病亲本泗棉3号与抗病亲本中植棉2号杂交产生F1，同年南繁自交获得F2。2013年在南京黄萎病人工病圃进行抗病鉴定，筛选抗病单株，同年南繁自交，于2014年和2015年连续2年进行自交和抗病鉴定，获得抗病株系苏VR018。2015年在黄萎病人工病圃，利用苏VR018与感病亲本泗棉3号杂交，获得F1，2015年冬季南繁获得F2。2016年将包含312个单株的F2群体种植在江苏省农业科学院棉花育种基地，同年，F2单株自交获得F2∶3家系种子。2016年冬天，于江苏省农业科学院温室用黄萎病菌株V991接种苏VR018、泗棉3号、中植棉2号和F2∶3家系。本研究所用的泗棉3号来源于本研究室保存的自交纯合种子，中植棉2号由中国农业科学院棉花研究所提供。

本试验所用棉花落叶型黄萎病菌株V991由江苏省农业科学院植物保护研究所提供，由本实验室引进后自行分离提纯。

1.2 接种和性状调查

25 ℃下，将黄萎病菌涂布于固体土豆培养基(马铃薯200 g、琼脂17 g、蔗糖20 g、蒸馏水1 000 ml)表面，14 d后转移到液体土豆培养基(马铃薯200 g、蔗糖20 g、蒸馏水1 000 ml)中，室温下振荡培养5 d，测定孢子浓度，将液体稀释至每1 ml 5×107个孢子。将处理好的棉花种子播于温室中的营养钵中，1钵2粒，待棉株长到两叶一心时，进行营养钵撕底，以达到伤根的目的。用黄萎病病菌的分生孢子悬浮液进行接种，每营养钵10 ml。接种7 d后将营养钵中死苗全部拔除，定期观察棉苗发病情况，主要通过考察群体及亲本的叶片发病情况，具体鉴定方法参考Ning等[17]的方法。其中5级分类的标准如表1所示。根据调查结果计算病情指数，每个株系调查最少15株，试验设置3个重复。

病情指数= ∑(各级病株数×相应病级)/(调查总株数×4)×100%

表1棉花黄萎病叶片病级划分标准

Table1TheclassificationstandardofVerticilliumwiltcottonleaf

病级 叶片病害症状分级标准0健株,无病害症状1≤株25%叶片发病226%～50%叶片发病或脱落351%～75%叶片发病或叶片脱落仅剩心叶4≥76%叶片发病或全病死或脱落成光杆

1.3 DNA分子标记

按照 Paterson等[18]的 CTAB 法提取苏VR018、泗棉3号和312个F2单株的 DNA。 根据已经公布的棉花遗传图谱，选择分布在棉花26条染色体上的3 100对SSR (Simple sequence repeat) 引物检测2个亲本基因组之间的多态性，利用亲本间存在多态的引物对F2单株进行扩增检测。所有SSR引物信息均可从 http://www.cottonmarker.org下载得到。 PCR 扩增、产物电泳和银染参照张军等[19]的方法。

1.4 数据分析和连锁图构建

用JoinMap3.0软件分析标记间的连锁关系，构建分子遗传图谱[20]， 连锁的最低LOD值为2.5，最大遗传距离为50 cM。采用 Windows QTLs Cartographer 2.0结合复合区间作图法(Composite interval mapping，CIM)检测抗病性状的 QTL[21-22]。通过1 000次随机抽样确定LOD阈值。

2 结果与分析

2.1 苏VR018主要农艺性状、纤维品质及抗病性表现

为更加详细地了解苏VR018的特征，我们比较了苏VR018、泗棉3号和中植棉2号的主要农艺性状、纤维品质及抗病性表现。结果(表2)表明，中植棉2号与泗棉3号之间在果枝数、衣分、纤维整齐度、纤维生产率、纤维比强度以及抗病性方面存在显著或极显著差异。在中植棉2号与泗棉3号杂交后代中选育的苏VR018与泗棉3号相比，其纤维整齐度、纤维比强度以及对黄萎病的抗性方面得到显著改良，但是衣分没有显著提高(表2)。在苏VR018的选育过程中，主要目的是将中植棉2号对黄萎病的抗性向陆地棉泗棉3号转育，因此苏VR018的抗病性得到极显著提高。该结果表明，通过系统选育成功地将中植棉2号的部分抗病相关位点转育到新品系苏VR018中。苏VR018与亲本泗棉3号在抗病性状方面有较大的遗传差异，适合进行抗病性状的分子标记。

表2苏VR018、泗棉3号和中植棉2号主要农艺性状、纤维品质及抗病性平均表现值

Table2Averageperformancevaluesofagronomiccharacters,fiberqualityandresistancetoVerticilliumwiltofSuVR018,Simian3andZhongzhimian2

性状 泗棉3号苏VR018中植棉2号株高(cm)98.397.1103.0果枝数 16.516.414.8*铃数 18.717.816.1单铃质量(g) 5.15.25.9衣分(%)43.239.2*39.4*纤维长度(mm)30.430.129.3整齐度(%)75.884.2*84.7*马克隆值4.94.94.7生长率(%)7.66.96.6*比强度(cN/tex)23.529.1**29.2**病情指数 (%)56.728.3**20.8**

*表示与泗棉3号相比差异显著(P<0.05)；**表示与泗棉3号相比差异极显著(P<0.01)。

2.2 F2∶3群体病情指数

对亲本及其F2∶3群体进行抗病鉴定，结果表明2个亲本的抗病性存在显著差异。对F2∶3群体抗病鉴定结果统计分析，显示F2∶3株系中病情指数的最大值为71.1%，最小值为3.7%，中亲值为41.2%，病情指数平均值为36.1%，偏度系数为0.12， 峰度系数为0.60，广义遗传力分别为0.7。另外，F2∶3群体病情指数表现为单峰连续分布，没有明显的比例关系，表现出数量性状的遗传特点(图 1)。因此我们认为苏VR018对棉花黄萎病的抗性属于多基因控制，适于进行QTL定位。

图1 F2∶3群体病情指数频率分布图Fig.1 Frequency distributions of disease index in F2∶3 population

2.3 苏VR018遗传背景分析及连锁图构建

利用3 100对SSR引物，对泗棉3号和苏VR018进行多态性分析，筛选到多态性标记32个，分布在18条染色体上，多态率为10.3%。用在双亲之间存在多态性的SSR引物对312个F2单株进行分析，共得到32个位点，经卡方检测有3个位点偏分离，在构建连锁图时剔除这些偏分离的位点。

用Joinmap 3.0软件构建连锁群(LOD≥3.0)。最终得到1个包含17个位点和6个连锁群的连锁图谱(图2)。构建的连锁群长度18.30～44.70 cM，图谱总长198.00 cM，标记间平均遗传距离为10.42 cM，每个连锁群标记数为2～4 个。根据棉花微卫星数据库提供的信息对连锁群中SSR 标记进行染色体定位，6个连锁群被分别定位在 染色体5(染色体A5)、染色体12(染色体A12)、染色体17(染色体D3)、染色体19(染色体D5)、染色体22(染色体D4)和染色体25(染色体D6)上。

图2 棉花抗黄萎病QTL定位Fig.2 QTL mapping of cotton resistance to Verticillium wilt (VW)

2.4 棉花抗黄萎病QTL 检测

用Windows QTL Cartographer 2.5 软件，通过复合区间作图法分析F2∶3家系的抗黄萎病QTL，通过1 000 次随机抽样确定LOD阈值为2.5。利用F2∶3家系接种落叶型黄萎病菌V991后调查获得的病情指数，共检测到4个与棉花抗黄萎病相关的QTL (表3)。分别位于染色体5(染色体A5)、染色体19(染色体D5)、染色体19(染色体D5)和染色体25(染色体D6)染色体上，位于标记HAU883-NAU3212、MGHES40-MUSS138、MUSS138-DPL209和NAU3171-CIR181之间，LOD值分别为4.12、2.67、4.20和3.81，分别命名为qVW-V991-1、qVW-V991-2、qVW-V991-3和qVW-V991-4。 这4个QTL 加性效应分别为-0.041 4、0.034 1、0.031 2和-0.030 5。显性效应分别为0.089 2、0.137 0、0.037 4和0.194 0。表型贡献率分别为6.41%、3.78%、4.61% 和5.76%，4个QTL共解释20.56%的表型变异。

表3利用复合区间作图法(CIM)检测到的与抗黄萎病相关的QTL

Table3QTLanalysesforVWresistancedetectedbycompositeintervalmapping

QTL名称染色体位置 (cM) 两侧标记LOD值加性效应显性效应贡献值(%)qVW-V991-1A536.50HAU883-NAU32124.12-0.041 40.089 26.41qVW-V991-2D50.01MGHES40-MUSS1382.670.034 10.137 03.78qVW-V991-3D518.90MUSS138-DPL2094.200.031 20.037 44.61qVW-V991-4D65.01NAU3171-CIR1813.81-0.030 50.194 05.76

本研究还利用TASSEL 2.1软件[23]的一般线性模型(General linear model，GLM)程序，将32个位点的等位变异分别与抗病性进行关联分析。结果显示，采用一般线性模型检测到与棉花抗黄萎病显著关联的位点5个，分别为位于染色体5(染色体A5)上的标记NAU3212， 染色体19(染色体D5)上的标记MGHES40和DPL209，染色体25(染色体D6)上的标记CIR181，另外1个关联位点为没有进入连锁群的标记NAU5204。5个位点表型变异解释率分别为6.38%, 1.50%, 2.80%, 2.10% 和2.20%，5个位点共解释14.98%的表型变异(表4)。

表4与黄萎病抗性显著相关的标记位点及其对表型变异的解释率

Table4MarkerlociassociatedwithresistancetoVWandtheinterpretationrateforphenotypicvariation

标记染色体p-GLMr2-GLMNAU3212A50.000 070.063 8MGHES40D50.039 150.015 0NAU5204A120.017 600.028 0CIR181D60.015 700.021 0DPL209D50.006 930.022 0

p-GLM为一般线性模型(GLM)p值，r2-GLM为解释表型变异率。

3 讨 论

棉花黄萎病是中国棉花生产的主要限制因素，棉花育种专家在棉花抗黄萎病育种和抗黄萎病分子机制解析方面做了大量工作，取得了一定进展，但是由于缺乏对黄萎病高抗或免疫的陆地棉栽培品种，研究进展缓慢。在中国棉花抗黄萎病育种中中植棉2号常被作为抗源，同时，一些研究者也对中植棉2号的抗黄萎病机制进行了研究。祁伟彦等[24]研究结果显示，中植棉2号黄萎病抗性与SSR标记NAU1269、NAU828和NAU1225连锁，利用标记NAU1269、NAU828和NAU1225的序列，在棉花全基因组中进行比对，结果显示，标记NAU1269、NAU828和NAU1225分别位于棉花基因组的A5(13830896), D5(13669157)和D5(13669176)染色体上。本研究定位的4个QTL中的3个位于染色体A5和D5上，通过比对定位在A5和D5上的3个QTL连锁标记序列发现，标记CIR139(D5:13516109)、MGHES40(D5:20109590)和NAU3212(A5:11483877)在基因组中位置与标记NAU1269、NAU828和NAU1225位置相邻(括号中数字代表正向引物在染色体中的位置)。这初步表明本研究定位的3个位于染色体A5和D5上与抗黄萎病相关的QTL可能与祁伟彦等[24]研究的是相同的位点。张华崇等[25]以感病品种861为父本、中植棉2号为母本配制杂交组合，构建6个世代群体，并在田间病圃进行抗病性鉴定，利用主基因-多基因混合遗传模型的多世代联合分析法对中植棉2号的抗病性进行分析。张华崇等[25]研究结果表明，中植棉2号抗性遗传符合2对加性-显性-上位性主基因+加性-显性多基因遗传模型，F2的主基因遗传率达到82.09%。本研究在中植棉2号和泗棉3号的杂交F2群体中选育的抗病株系苏VR018，其遗传背景与泗棉3号相近，是解析中植棉2号抗病性的理想材料。比较苏VR018、中植棉2号和泗棉3号的农艺性状和抗病性，结果显示苏VR018病情指数与中植棉2号相比存在显著差异，但相比于泗棉3号，抗病性得到极显著提高。这也暗示中植棉2号抗病性的遗传率比较高，2对抗病主基因可能转育到了抗病株系苏VR018中。通过与中植棉2号杂交，可以在低世代中选育出抗黄萎病新品系。

关于棉花抗黄萎病基因QTL的定位已有报道，但是陆地棉的抗黄萎病QTL定位报道不多，这与陆地棉遗传基础狭窄，遗传图谱标记密度不足有关[14,17,26-29]。本研究利用3 100对SSR分子标记进行连锁图构建，只获得32对具有多态性的标记，多态率只有10.3%，这与陆地棉遗传基础狭窄，标记多态率低有关，但是更重要的原因是本研究使用的抗病亲本苏VR018是从感病亲本泗棉3号与中植棉2号杂交后代中选育的新品系，其遗传背景与泗棉3号非常相似，这进一步导致其与泗棉3号之间标记多态率降低。4个QTL解释20.56%的表型变异，利用单标记分析检测到的5个关联位点，解释表型变异也只有14.98%。我们推测可能的原因有2点，一是本研究构建的遗传图谱覆盖率低，没有完全覆盖苏VR018携带的黄萎病抗性位点，导致苏VR018中其他的抗病位点没有检测到；二是苏VR018中黄萎病抗性位点具有病菌专化特性，其他的抗黄萎病位点对黄萎病菌V991没有抗性。因此，通过继续增加标记密度和标记类型来解析苏VR018的抗病位点将是下一步工作的重点。

本研究在D6染色体上检测到的QTL可能是一个新的抗黄萎病位点。Zhang等[12]分析了目前已经公布的棉花抗黄萎病QTL，结果显示在A6染色体上存在至少8个抗病相关的QTL，而D6染色体上只存在2个抗黄萎病相关QTL。这有2个方面原因，一是D6染色体上存在的抗黄萎病QTL确实少，另一个原因是由于使用不同的棉花品种和黄萎病菌株，D6染色体上的QTL没有检测到。本研究定位在D6染色体上的抗病位点连锁标记NAU3171与已经公布的D6染色体上的QTL联锁标记BNL3436在D6染色体上遗传距离较远，初步判断可能不是同一个抗病位点。该位点在今后研究中需重点关注。