赵立春 张亚玉 李小沛 吕林 刘继永

摘要：通过正交试验设计优选出人参多糖的最佳提取工艺条件。首先对人参多糖的3种提取方法（微波辅助热水提取法、超声辅助热水提取法、索氏提取法）进行单因素试验，优选出各自的4种因素及3个水平，再采用L9（34）正交试验设计，对3种提取方法分别进行正交设计试验，并采用硫酸蒽酮比色法和硫酸苯酚比色法检测多糖含量，通过比较人参多糖得率，确定最佳提取工艺。结果显示，微波辅助热水提取人参多糖最优工艺组合如下：当功率为400 W时，其料液比为1 g ∶50 mL、微波时间为3 min、提取时间为90 min、提取温度为95 ℃，人参多糖的提取率为19.32%;超声辅助热水提取人参多糖的最优工艺组合如下：当超声频率为200 W时，其料液比为1 g ∶55 mL、超声时间为25 min、超声温度为80 ℃、超声次数为2次，人参多糖的提取率为34.12%;而索氏法提取人参多糖的最佳工艺条件为料液比1 g ∶20 mL、提取时间120 min、提取温度100 ℃、提取次数2次，其多糖的提取率为24.13%。通过比较可知，超声辅助热水提取人参多糖的提取率最高，且时间短、节省能源、装置简单、操作简便。

关键词：人参多糖;提取工艺;正交设计;微波辅助;超声辅助;索氏提取

中图分类号：S567.5+10.1文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）21-0254-06

收稿日期：2018-08-02

基金项目：农业农村部农产品质量安全——人参产品质量安全风险评估（编号：GJFP201801002）。

作者简介：赵立春（1992—），男，山东德州人，硕士研究生，主要从事药用植物质量评价与利用研究。E-mail：1453041608@qq.com。

通信作者：刘继永，博士，研究员，主要从事药用植物质量评价与利用研究。E-mail：ljy1107@126.com。

人参（Panax ginseng C.A. Mey）为五加科（Araliaceae）人参属（Panax）多年生草本植物，享有“百草之王”的美誉[1]。人参中化学成分复杂，包含人参皂苷、多糖、氨基酸、无机元素等[2]，在发挥其整体药用价值的基础上，单一化学成分具有其独特的药理活性。人参多糖（ginseng polysaecharide，简称GPS）作为主要的活性成分之一，具有抗肿瘤、抗血栓、增强免疫力、抗病毒、抗衰老、促进造血功能等药理作用[3-6]。以人参多糖为指标性成分的质量评价方法众多，主要有索氏提取法、超声波辅助热水提取法、微波辅助热水提取法等[7-8]。本试验采用正交设计，对上述3种提取方法分别进行工艺优化，以期得到最优工艺条件，为精准评价人参质量提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

鲜人参，为吉林抚松万良人参市场市售;苯酚、蒽酮、浓硫酸、D-无水葡萄糖、无水乙醇、无水乙醚等，均为分析纯。

1.2仪器与设备

DK-98-ⅡA电热恒温水浴锅，购自天津泰斯特仪器有限公司;光电微波炉，购自格兰仕微波炉电器有限公司;UV-2550紫外/可见分光光度计，购自德国耶拿分析仪器股份有限公司;超声波清洗器，购自昆山市超声仪器有限公司;万分之一电子天平，购自梅特勒公司;HC-3018高速离心机，购自安徽中科中佳科學仪器有限公司;电热鼓风干燥箱，购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂;索氏回流器等玻璃仪器，均购自天津玻璃仪器厂。

1.3样品处理

将鲜人参洗净，用超纯水清洗3遍，晾干，置于40 ℃烘箱，烘干至恒质量，粉碎，过60目筛，称取适量人参粉末脱脂，按1 g ∶40 mL 比例加入无水乙醚，回流3 h，脱脂，备用。

1.4溶液配制

0.1%硫酸蒽酮溶液：精确称取蒽酮0.1 g，加硫酸100 mL 溶解，摇匀，备用。

5%苯酚溶液：将固体苯酚于60 ℃水浴完全融化，精确吸取5 mL于100 mL容量瓶中，加入蒸馏水定容，备用。

D-无水葡萄糖对照品溶液：精确称取D-无水葡萄糖标准品适量，加蒸馏水配制成浓度为0.12 mg/mL的溶液。

1.5供试样品溶液制备

精确称取样品2 g，置于圆底烧瓶中。按照L9（34）正交设计，过滤收集滤液，分3次洗涤滤渣，最终将滤液转移至蒸发皿。水浴蒸干，其残渣用5 mL热蒸馏水溶解，再边搅拌边加入无水乙醇75 mL，将其转移至聚乙烯离心管中，放置于4 ℃ 冰箱中12 h，于4 ℃、6 000 r/min离心5 min，弃去上清液，沉淀再加蒸馏水溶解，重复醇沉3次。转移至100 mL容量瓶中，用冷却蒸馏水定容，取适量溶液，离心取上清液2 mL，至50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，摇匀备用。

1.6标准曲线绘制

1.6.1硫酸蒽酮比色法绘制标准曲线

精确量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于10 mL具塞试管中，加蒸馏水至2.0 mL，缓慢加入0.1%硫酸蒽酮溶液6 mL，立即摇匀，放置15 min，冰浴15 min，取出，以相应的空白作对照，在波长625 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.6.2硫酸苯酚比色法绘制标准曲线

取对照品溶液于10 mL 具塞试管中，定容至2 mL，加入5%苯酚溶液1 mL，再缓慢滴加浓硫酸5 mL，迅速振摇混匀，于室温下静置10 min，立即放于沸水中20 min，取出，在490 nm波长处测定其吸光度。以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.7样品测定

精确量取待测样品溶液2 mL于10 mL具塞试管中，设置2组重复，按“2.4”节方法测定，按照以下公式计算多糖的提取率[9]。人参粗多糖提取率=人参粗多糖含量（g）/原料人参质量（g）×100%。

2结果与分析

2.1单因素试验

2.1.1微波辅助热水提取法

微波辅助热水提取法提取人参多糖较优于直接热水提取法，其影响因素有微波功率、料液比、微波时间、提取时间、提取温度等[9-10]。参照表1进行单一因素试验，选择最佳工艺因素和水平。单因素试验所形成的多糖提取率趋势见图1至图5。

2.1.2超声辅助热水提取法

超声辅助提取人参多糖是一种较为高效的提取人参多糖的方法。据报道，试验的影响因素较多，有超声功率、料液比、超声时间、超声温度、超声次数等[11-13]。按表2条件进行单因素试验，考察因素对于结果的影响，选择最佳因素及水平。由图6至图10可以看出超声功率、料液比、超声时间、超声温度、超声次数等因素对于人参多糖提取率的影响。将超声功率为200W设定为固定条件，选择其他4个因素的合适水平，建立4因素3水平正交试验，优选超声辅助法提取人参多糖的最佳工艺条件。

2.1.3索氏提取法

索氏法提取人参中多糖的操作较为简单，但是耗时较长。据报道，提取温度、料液比、提取时间、提取次数等会在不同程度上对试验产生影响[14-15]。按表3条件进行单因素试验，考察最佳工艺因素和水平。

在控制其他因素的基础上形成单一变量，研究其对于试验的影响。由图11至图14可以看出浸提温度、料液比、浸提时间、提取次数等试验因素对人参多糖提取率的影响。选择4种试验因素的合适水平，建立4因素3水平正交试验（表4），优选索氏法提取人参多糖的最佳工艺条件。

2.2正交试验

根据上述单因素试验，采用L9（34） 4因素3水平正交试验，优化人参多糖提取工艺参数。因素水平见表4。

2.2.1微波辅助热水提取法

以标准溶液浓度为横坐标（X）、吸光度为纵坐标（Y）绘制标准曲线，通过硫酸蒽酮比色法得到的标准曲线回归方程为Y=0.037X-0.013 3，r2=0.999 7。通过硫酸苯酚比色法得到的标准曲线回归方程为Y=0.039 8X+0.044 6，r2=0.999 3。

由表5可知，在微波辅助提取人参多糖的试验中，对于试验所得2种比色方法检测的多糖提取率，虽然试验结果不尽相同，但是其各自的最优组合相符。最优工艺组合为第8组（A3B2C1D3），即当微波功率为400 W时，最佳工艺条件为料液比1 g ∶50 mL、微波时间3 min、提取时间90 min、提取温度95 ℃。

使用SAS 9.0对正交试验结果进行方差分析，由表6得出，4种试验因素对于人参多糖的提取率都有显著影响。其对于试验的影响力排序为微波时间>提取时间>提取温度>料液比。

2.2.2超声辅助热水提取法以标准溶液的浓度为横坐标（X）、吸光度为纵坐标（Y）绘制标准曲线，通过硫酸蒽酮比色法得到的标准曲线回归方程为Y=0.064 0X-0.090 3，r2=0.999 2。通过硫酸苯酚比色法得到的标准曲线回归方程为Y=0.039 6X+0.032 5，r2=0.999。

由表7可知，在本试验中2种比色法所得最优组合相符，即最优试验组合为第7组（A3B1C3D2），最佳工艺条件为料液比1 g ∶55 mL、超声时间25 min、超声温度80 ℃、超声次数2次。

使用SAS 9.0对正交试验结果进行方差分析，由表8得出，4种因素对于本试验的影响力排序为超声温度>超声时间>超声次数>料液比。对于整个试验来说，4种试验因素对于人参多糖的提取率影响最高的为超声温度。

2.2.3索氏提取法

以标准溶液的浓度为横坐标（X）、吸光度为纵坐标（Y）绘制标准曲线，通过硫酸蒽酮比色法得到的标准曲线回归方程为Y=0.028 1X+0.056 9，r2=0.999 4。通过硫酸苯酚比色法得到的标准曲线回归方程为Y=0.066 6X-0.012 7，r2=0.999 9。

由表9可知，在索氏提取法提取人参多糖的试验中，2种比色法的最优组合相符，都为第5组（A2B2C3D1），最佳工艺条件为料液比1 g ∶20 mL、提取时间120 min、提取温度100 ℃、提取次数2次。

由表10的方差分析结果得出，对于整个试验来说，4种试验因素对于人参多糖的提取率都有顯著影响，其影响力排序为提取次数>提取温度>提取时间>料液比。

2.3验证试验

根据正交试验结果，用优选出的3种提取方法的最佳提取工艺条件进行人参多糖的提取，同时设置3组重复，求其平均值，比较并选择人参多糖的最佳提取工艺，结果见表11。

如表11所示，对3次重复试验所得值求平均，其平均值与正交试验所得结果大致相同，说明试验的数据准确，最佳工艺的试验重复性较好。

3结论

通过对整个试验过程及结果分析得出，超声辅助热水提取法以提取率35.05%、34.12%的结果明显高于其他2种方法;超声辅助热水提取法明显优于其他2种方法的最优组合，且该方法具有时间短、节省能源、 操作简便、产品提取率高等优点。能够满足工厂化的需要。

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