薛艳 李英 谌国鹏 张星 陈乔 何忠军 王风敏 李虎

摘要：为揭示高油甘蓝型油菜种质资源的遗传背景，明确各材料间的遗传距离，加快陕南地区高油育种进程，利用20对甘蓝型油菜首选的简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）核心引物，对陕南地区65份含油量达40.58%～53.52%的甘蓝型油菜育种材料进行遗传多样性分析，利用NTSYS-pc1.10e计算材料间多态性信息含量指数（PIC），并用非加权配对算术平均法（unweighted pair group method using arithmetic average，UPGMA）对材料进行聚类分析。结果表明，从20对SSR核心引物中共筛选出7对最佳引物，平均每对引物检测到7个条带。供试材料的PIC值分布在0.33～0.86范围内，平均值0.58。聚类分析结果表明，在相似系数为0.54处将65份供试材料划分为两大类群。供试材料的遗传距离较近，不利于陕南地区高油甘蓝型油菜的育种工作。加强种质创新，引进外来优良种质资源并加以改造利用是提高陕南地区高油甘蓝型油菜育种水平的根本途径。

关键词：SSR标记;高含油量;甘蓝型油菜;遗传多样性;种质资源

中图分类号： S565.403文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）21-0124-04

收稿日期：2019-02-21

基金项目：陕西省重点研发计划（编号：2017ZDXM-NY-006）。

作者简介：薛艳（1982—），女，陕西汉中人，硕士，农艺师，主要从事油菜分子育种研究。E-mail：791477005@qq.com。

通信作者：李英，研究员，主要从事油菜遗传育种研究。E-mail：liying3315@163.com。

油菜是重要的油料作物之一，2017—2018年我国油菜种植面积高达720万hm2。目前長江流域是我国油菜主产区，其种植面积占全国总量的70%，种植类型以甘蓝型油菜为主。甘蓝型油菜是芸薹和甘蓝的种间杂交复合种[1]，起源于欧洲，其杂种优势明显，在产量、品质及抗性方面都较常规种具有显著优势。由于地域因素及起源历史较短等原因，甘蓝型油菜在我国的遗传背景比较狭窄，基因资源的不足限制了杂种优势的有效利用。油菜的高含油量一直是重要的育种目标之一，油菜种子含油量的高低直接关系到单位面积的产油量。早在20世纪苏联科学家就曾预言，油菜种子的含油量有望达到60%，现在这一目标已经实现并有所突破，我国新审定油菜品种的含油量也有了大幅度提升[2]。高含油量油菜品种的选育基础是高油种质资源，而杂种优势的利用是实现高含油量育种目标的重要途径[3]。将遗传多样性分析应用到油菜高含油量育种资源筛选中，可以明确材料间的亲缘关系和遗传距离，对油菜高含油量育种中的亲本选配进行指导，可有效提高育种效率，同时还能为改良现有高含油量材料提供参考。因此，对油菜高含油量种质资源进行遗传多样性分析，对于育种材料的发掘利用和新品种的选育具有重要意义[4]。

随着DNA分子标记方法的建立，从分子水平上揭示品种之间的遗传变异已成为当今作物育种家们的研究重点。简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）标记具有数量丰富、覆盖整个基因组且分布均匀、多态性高、稳定性高、试验操作技术简单等优点。已有大量研究证明，SSR标记能够检测不同油菜种质资源的特异性，有效指导种质资源的有效利用，因此成为研究油菜遗传多样性的有效方法[5]。

在进行遗传多样性分析时，引物的筛选是整个试验非常关键的步骤。李海渤等利用100份具有代表性的甘蓝型油菜品种（系）从746对SSR引物中进行筛选，通过综合考量，最终确定44对引物为甘蓝型油菜核心引物，其中20对引物为首选核心引物，24对引物为备选核心引物[6]。本试验从20对首选核心引物中再次筛选出7对最佳引物，对汉中地区目前主要利用的甘蓝型油菜高含油量育种材料的遗传背景进行全面分析，以期为改良育种材料和选育新高含油量品种提供理论指导。

1材料与方法

1.1试验材料

试验材料由汉中市农业科学研究所油菜研究室提供，总共65份，其中有50.8%的材料是该所自育材料。在所有材料中，含油量在40%～45%之间的共23份，在45%～50%的共32份，还有10份材料的含油量在50%以上，属于特高含油量油菜（表1）。

1.2试验方法

1.2.1样品DNA提取采用十二烷基苯磺酚钠（SDS）法[7]提取油菜基因组DNA。

1.2.2DNA检测油菜基因组DNA采用0.8%琼脂糖凝胶进行检测，电泳条带越清晰DNA质量越高。

1.2.320对SSR引物序列的PCR扩增参照甘蓝型油菜首选核心引物（表2）[6] 从中筛选出具有较高多态性的引物

加以利用。PCR反应体系：2×Taq master MIX 7.5 μL，10 μmol/L 的正反引物各1 μL，50 ng/μL DNA模板1.0 μL，ddH2O 4.5 μL，反应总体积15 μL。反应程序为94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，10个循环，每循环退火温度降低0.5 ℃;94 ℃变性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30个循环;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存反应产物。

1.2.4凝胶电泳采用8%变性聚丙烯酰胺凝胶对PCR扩增产物进行电泳，电压为150 V，电泳时间为1.5 h。

1.2.5染色电泳完成后，用硝酸银染色显带，具体包括8个步骤：固定→水洗→染色→快速漂洗→显影→停显→漂洗→ 保存[7]。

1.2.6凝胶摄影将完成显色的凝胶放到凝胶成像仪中在白光下拍照。

1.3数据处理与分析

统计时将清晰的条带记作“1”，无条带记作“0”，缺失条带记作“9”，建立原始数据矩阵。利用NTSYS-pc2.10e系统软件中的相似性系数（DICE）法计算材料间的遗传相似系数，用非加权配对算术平均法（unweighted pair group method using arithmetic average，UPGMA）进行遗传聚类分析并绘制聚类树状图。多态性信息含量指数（PIC）采用Smith等报道的方法[8]计算，PIC值能够准确反映出每对SSR引物区分材料的能力。其计算公式为PIC=1-∑nj=1P2ij。式中：PIC表示位点i的PIC值;Pij表示位点i的第j个等位位点出现的频率，位点i的带型为1～n;PIC为0～1，0代表位点无多态性，1代表位点具有多个等位位点。每个标记的多态性程度用多态性含量指标衡量，当PIC>0.50时，该基因座为高度多态基因座，025≤PIC≤0.50时为中度多态基因座，PIC<0.25时为低度多态基因座[9]。

2结果与分析

2.1SSR标记的扩增片段多态性

如表3所示，从20对油菜核心引物中再次筛选得到7对稳定、扩增效果好、多态性丰富、不同材料之间差异明显的SSR引物，这7对SSR引物在65个不同含油量油菜材料中共检测出49个等位变异，单个SSR引物检测到的等位变异数介于4～11之间。其中引物CB10028扩增的等位变异数最多，为11个（图1），而引物CB10587最少，仅4个。

每个SSR位点的多态性含量指数在0.33～0.86之间，平均值为0.58，说明筛选出的引物具有较强的材料区分能力，这7对SSR引物的带型组合能够准确区分65份供试材料。用这些SSR标记研究的65份油菜材料的遗传多样性处于中高度多态水平，其中通过引物CB10587检测到的位点遗传多样性最高，达到0.86，而通过CB10036检测到的位点遗传多样性最低，只有0.33。

2.2聚类分析

如图2所示，在相似系数为0.54处，65份供试材料被划分为两大类群。第1类群包括53个材料，第2类群包含12个材料。两大类群又各自被划分为2个亚组，第1类群的第1亚组包括312A、浙50等43个材料，其中青杂3A-B和CYZ0201FR的遗传相似系数最高，达到0.90;第1类群的第2亚组包括汉3A、中11/中821核选等10个材料。第2类群的第1亚组包括09-4082-1、DW-4R等10个材料，其中9816/中4A/HSTC5//D4R///F2-2FR和H16A/R11R遗传相似系数最高，达到0.92;第2亚组只有N58A-B-R和H6R这2个材料。本试验中材料来源较丰富，根据材料来源来看，来自同一个地区或相邻地区的材料遗传相似系数较高，在聚类图中也明顯聚在一起。如分别来自安徽、湖北、湖南和江苏的材料H82J24、Z2R、HSC4R、X98R和杨4在聚类图中就分到同一类中，而来自四川和陕西的材料也多分布于同一类中，而且它们的含油量也比较接近。从聚类图中还可以看出，有相同亲缘的材料也都是最先聚在一起，如中11-1/浩11和中11/青杂早。

为了检验试验结果的准确性，所有试验材料都随机编号，对几个亲缘关系相近的材料编不同序号，另外在同一材料上取2份样品标记不同编号。从试验结果来看，最先聚在一起都是亲缘关系最近的材料，如杂03-92-1和杂03-92-2、H105FR和H109FR、Q11R和Q10R以及中4A/HSTC5//D4R///F1-1和中4A/HSTC5//D4R///F2-2FR，说明本试验结果科学可靠，用SSR分子标记对油菜种质资源进行遗传多样性分析，可以准确地掌握材料间的遗传背景和亲缘关系。根据本试验结果，可以将遗传距离较远的高含油量不育系和恢复系进行配置组合，如汉3A（46.91%）和中11/青杂早（5352%）或者Z11A（47.82%）和浙50选系（50.98%）;也可以将遗传距离较远的高含油量恢复系进行杂交，以提高其含油量，如2061FR（52.55%）和H6R（43.37%）、S12R（4885%）和DW-4R（48.13%），而这些新组合在实际生产中是否具有较强的杂种优势、具备更高的含油量还有待进一步研究。

3讨论与结论

目前油菜新品种选育以杂交育种为主，利用杂种优势是提高油菜产量和品质最有效的途径[10]。陕西省的杂交油菜育种水平位居全国前列，世界上第1个杂交油菜品种秦油2号就是在陕西省育成的。汉中地区不仅是陕西省油菜生产的最佳适生区，也是全国范围内油菜种植最佳适生区之一，油菜制种水平较高。汉中市农业科学研究所开展了油菜分子育种方面的研究，分子辅助育种技术在新品种的选育中发挥了积极作用。近年来，汉中市农业科学研究所已有4个品种通过陕西省审定登记，其中汉油8号还通过了国家审定，且通过审定的油菜品种的含油量已大幅度提高，如已审定的新品种汉油1618，其含油量高达46.04%，其亲本在本研究中分属于两大不同的杂种优势群，亲本的含油量都在45%以上，遗传距离较远。另外表现优异正在登记的新品种汉油1418和汉油10号，其亲本含油量都较高，在本研究中也分属于不同类群且遗传距离较远。说明在一定范围内 油菜高含油量亲本材料的遗传距离越大，杂种优势越强，选育出的品种含油量较高，这与前人的研究结果[11]一致。

核心引物的概念源于核心种质。核心种质是指最小数量的种质资源最大限度地代表整个资源的多样性。而核心引物是用最少数量的引物最大限度地检测基因型，节约大量的引物筛选时间，从而提高检测效率，降低成本[12]。本试验筛选了7对核心引物，将供试65份油菜高油材料进行了准确分析。这些材料的遗传相似系数分布在0.54～0.92之间，说明供试材料的遗传相似度较大，遗传背景较为狭窄。遗传基础狭窄主要是因为各个育种单位的育种目标相同，对已有的高含油量育种材料的交流和使用太过频繁。加强种质创新研究，扩大对外来优良种质资源的引进和利用研究，是目前提高汉中地区油菜高含油量育种水平的重要途径[11]。分子标记是进行遗传多样性分析最有效的工具，将SSR分子标记应用到育种工作中，通过分析各亲本的亲缘关系与遗传距离，指导杂交育种和优势组合选配，加强目标育种的亲本选配效果，将更有利于加快育种进程，选育出具有更高含油量的突破性品种。

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