王维力 明 李 阮尚全,2 汪建红,2

(1. 内江师范学院化学化工学院，四川 内江 641199；2. 四川省高等学校果类废弃物资源化重点实验室，四川 内江 641199)

中国荔枝种植主要分布在两广、福建、海南、四川、台湾等地区，在食用、尤其是生产加工中产生的果皮以丢弃为主，四川合江县栽植面积已超过2.0×104hm2，年产量达2.0×107kg，果皮按16%计算[1]1，可达到3.20×106kg，其深度利用意义重大。荔枝皮中黄酮含量高达17.92%[2]，在医药、食品、化妆品等行业具有极大开发前景[3-4]。目前荔枝皮黄酮提取方法有直接水浴加热法[1]40-41、超声波提取法[5]、微波与超声波耦合[6]、酶法与超声波耦合[7]等，鲜见用双水相技术提取的研究报道。微波能显著缩短提取时间，提高产率，文献[8～9]用微波法和超声波法提取同一榴莲皮中的黄酮，微波法将提取时间由50 min缩短到120 s，产率由3.26%提高到4.84%。双水相体系因条件温和、溶剂易回收、易于连续化操作等优点，广泛应用于生物、食品、制药等领域，已有工业化应用报道[10-13]。

本试验拟以四川合江县荔枝皮为材料，微波和双水相技术的优点相结合，用响应曲面优化建立提取其中黄酮的理论模型和试验方法，获得各因素与响应值之间的函数关系，得到因素的最佳组合，并对提取物清除DPPH·进行了试验，以期为合江荔枝皮的深度利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

紫外可见分光光度计：T6-新世纪型，北京普析通用仪器有限公司；

离心机：TD-5型，四川蜀科仪器有限公司；

微波紫外超声波三位一体合成萃取仪：UWave-1000型，上海新仪微波化学科技有限公司；

中药粉碎机：DFT-10型，温岭市林大机械有限公司；

电热恒温鼓风干燥箱：DHG-9140A型，上海精宏实验设备有限公司；

电子分析天平：AE240型，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；

芦丁、抗坏血酸、二苯代苦味酰基苯肼(DPPH·)、亚硝酸钠、硝酸铝、无水乙醇、氢氧化钠、硫酸铵、磷酸氢二钾等：分析纯，成都金山化学试剂厂；

试验用水为蒸馏水；

荔枝皮:采自于四川合江县荔枝生产基地，果皮低温烘干至恒重，粉碎备用。

1.2 试验方法

1.2.1 芦丁标准曲线的绘制 准确称取芦丁标准品0.020 0 g，以60%乙醇溶解，定容于50 mL容量瓶中，移取0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00 mL于25 mL比色管中，根据文献[7] 方法测定，以吸光度为纵坐标，芦丁浓度为横坐标，用最小二乘法作线性回归曲线。

1.2.2 黄酮的测定 参照文献[7]，按式(1)计算黄酮得率。

(1)

式中：

R1——黄酮得率，%；

m1——黄酮质量，g；

m2——荔枝皮质量，g。

1.2.3 筛选分相盐 根据文献[14]修改如下：在乙醇体积分数为65%、微波时间为90 s、料液比为1∶40 (g/mL)、微波功率为250 W条件下，比较硫酸铵和磷酸氢二钾2种分相盐对荔枝皮中黄酮提取效果的影响。

1.2.4 单因素试验

(1) 乙醇体积分数：固定料液比1∶40 (g/mL)，微波功率250 W，提取时间90 s，考查乙醇体积分数 (55%，60%，65%，70%，75%)对黄酮得率的影响。

(2) 料液比：固定乙醇体积分数65%，微波功率250 W，提取时间90 s，考查料液比[1∶20，1∶25，1∶30，1∶40，1∶50 (g/mL)]对黄酮得率的影响。

(3) 硫酸铵用量：固定乙醇体积分数65%，料液比1∶40 (g/mL)，微波功率250 W，提取时间为90s，考查硫酸铵(7.5，10.0，12.5，15.0，17.5 g/100 mL)对黄酮得率的影响。

(4) 微波辐射时间：固定乙醇体积分数65%，料液比1∶40 (g/mL)，硫酸铵10 g/100 mL，微波功率250 W，考查提取时间(30，60，90，120，150 s)对黄酮得率的影响。

(5) 微波功率：固定乙醇体积分数65%，料液比1∶40 (g/mL)，硫酸铵10 g/100 mL，提取时间90 s，考查微波功率(200，250，300，350，400 W)对黄酮得率的影响。

1.2.5 Box-Behnken试验设计 以硫酸铵用量、微波功率、微波辐射时间为试验因子，黄酮得率为响应值，用 Design Expert 8.0 软件中Box-Behnken设计进行试验优化。

1.2.6 清除DPPH·试验 根据文献[15]修改为：DPPH·浓度为0.000 2 mol/L，取提取液(黄酮浓度为0.015 g/L) 0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.20 mL于25 mL的比色管中，加入DPPH·溶液2 mL，用95%乙醇准确补充至6 mL，摇匀，室温下避光放置30 min，以60%乙醇作参比，在517 nm 波长下测定吸光值Ai，用同法测定吸光值Ac和Aj，考查提取液清除自由基的性质，并与等浓度的VC和芦丁进行比对试验。清除率计算公式：

(2)

式中：

K——DPPH·清除率，%；

Ai——加入DPPH·的待测液吸光值；

Aj——待测液吸光值；

Ac——DPPH·吸光值。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线试验

如图1所示，芦丁标准曲线方程为A=0.011 1c-0.039 6，相关系数R2=0.999 4。

图1 芦丁标准曲线

2.2 分相盐试验

在有效分相条件下，硫酸铵和磷酸氢二钾对照试验结果：黄酮得率分别为14.65%和11.29%，可知硫酸铵对本材料更有效，同时硫酸铵作为一种酸性盐，具有溶解度大、易操作特点，适合提取黄酮类物质，故本试验确定硫酸铵为分相盐。

2.3 单因素试验

2.3.1 乙醇体积分数对黄酮得率的影响 如图2所示，在乙醇体积分数为55%～60%时，黄酮得率随乙醇体积分数增加有显著增长，65%时得率达到最高，60%～65%时得率增加不显著；当乙醇浓度继续增大时，黄酮得率有下降趋势，可能是杂质成分溶出竞争力增强和对微波的作用产生了影响，导致黄酮得率降低。因此确定最佳乙醇体积分数为60%。

2.3.2 料液比对黄酮得率的影响 如图3所示，料液比在1∶25～1∶50 (g/mL)时，黄酮得率随着溶剂量的增加而增加。料液比在1∶30～1∶40 (g/mL)时增加显著，在1∶40～1∶50 (g/mL)时增加较小，考虑到提取剂用量较大时，不仅增加了乙醇用量，增大了后续工序难度，还会导致生产成本增加，综合考虑选定1∶40 (g/mL)为最佳料液比。

图2 乙醇体积分数对黄酮得率的影响

图3 料液比对黄酮得率的影响

2.3.3 硫酸铵用量对黄酮得率的影响 如图4所示，黄酮得率随硫酸铵用量的增加先增加后减少，在硫酸铵用量为10 g/100 mL 时有最大值，但随着硫酸铵用量增加黄酮量减少，且10 g/100 mL时已出现少许的盐剩余，分相明显，综合考虑，选取硫酸铵用量为10 g/100 mL时最佳条件。

2.3.4 提取时间对黄酮得率的影响 如图5所示，随着提取时间延长，黄酮得率先增加后减少，在90 s时有最佳值，之后有减少。可能是最初微波提取时，黄酮溶出起主导作用，但加热时间过长，微波对黄酮类物质中有效成分结构破坏及降解逐渐凸显，从而导致得率降低。因此确定最佳提取时间为90 s。

图4 硫酸铵用量对黄酮得率的影响

图5 微波辐射时间对黄酮得率的影响

2.3.5 微波功率对黄酮得率的影响 如图6所示，最初黄酮得率随着微波功率的增加而增加，在250 W时有最佳值。因为微波功率越大，分子运动越剧烈，提取效率相对会越高，当微波功率过大时，活性分子运动过于剧烈，也加剧了活性物质间发生副作用，导致黄酮得率下降。另一方面也会加剧黄酮有效成分结构被破坏及其他杂质增加而不利于提取。故将250 W作为最佳功率。

图6 微波功率对黄酮得率的影响

2.4 响应曲面试验结果

2.4.1 因素水平及编码 见表1。

2.4.2 响应曲面试验结果及方差分析 固定乙醇体积分数为60%，料液比为1∶40 (g/mL)，以硫酸铵用量、微波功率、微波时间为变量因子，黄酮得率为响应值，设计三因素三水平Box-Behnken试验，试验结果见表2，方差分析见表3。

通过 Design Expert 8.0 软件对17组数据进行回归分析及拟合，得回归方程为：

R1=-12.842+3.514 5A+0.150 8B+0.145 3C-0.000 4AB+0.011 667AC-0.000 25BC-0.569A2-0.000 235 6B2-0.000 676 667C2。

(3)

表1 Box-Behnken 中心组合因素水平编码表

表2 Box-Behnken设计方案及试验结果

表3 回归模型方差分析结果†

2.4.3 黄酮得率的响应面分析 试验因子 A、B、C 所构成的响应曲面图如图7～9所示。

从响应曲面图可形象地看出图形均为山丘形曲面，有极大值，结合方差分析，可以得出微波功率在交互作用中对黄酮得率的影响最显著，微波时间的影响次之，硫酸铵用量的影响作用不够显著。利用 RMS 预测，通过对各个响应面最高点的极值分析及对最高点取值，并对多元二次回归方程进行求解，得出各个因子的解，最优工艺条件为：硫酸铵用量9.85 g/100 mL，微波时间91.79 s，微波功率268.03 W，在此条件下荔枝皮中黄酮得率的理论值可达20.947 8%。

2.4.4 验证实验 考虑到可操作性，以硫酸铵用量为10 g/100 mL、微波时间为90 s、微波功率为270 W验证 Box-Behnken 设计试验所得结果的可靠性，5次平行实验所得黄酮得率的统计均值为20.74%，与此条件下理论预测值20.94% 的相对误差为0.97%，表明该优化参数可靠，试验模型有指导意义。

图7 因素A和因素B对黄酮得率影响的响应面

Figure 7 Response surface plot about effects of factor A and factorB on yield of flavonoids

图8 因素A和因素C对黄酮得率影响的响应面

Figure 8 Response surface plot about effects of factor A and factor C on yield of flavonoids

图9 因素B和因素C对黄酮得率影响的响应面

Figure 9 Response surface plot about effects of factor B and factor C on yield of flavonoids

2.5 对DPPH·的清除效果

如图10所示，荔枝皮黄酮对DPPH·有一定的消除能力，且随样品浓度的增大而增强，在1.5 μg/mL浓度范围内呈现较好的量效关系，浓度达到0.25～1.50 μg/mL时，荔枝皮黄酮对DPPH·的清除作用好于VC、芦丁。

图10 不同清除剂的DPPH·清除率

3 结论

本研究充分利用了微波和双水相技术的优点，缩短了提取时间，溶剂易于回收。以Box-Behnken方法进行响应曲面设计，建立了微波联用双水相提取荔枝皮中黄酮的试验理论模型，得到的工艺参数为硫酸铵用量10 g/100 mL，微波时间90 s，微波功率270 W，黄酮得率为20.74%；提取物有较好的清除DPPH·的能力，存在较好的量效关系。后续将对黄酮的分离纯化及应用作进一步的研究。