吕丹丹 何 佳 宋文华 袁江月

(河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023)

凤丹(Paeoniaostii‘Feng Dan’) 又名铜陵牡丹，为芍药科芍药属植物，主要产于安徽铜陵，于2006年被中国质检总局列为“国家地理标志保护产品”[1]。牡丹花具有较高的药用价值[2]。2013年丹凤牡丹花被中国卫计委批准为新食品原料[3]。凤丹作为油用牡丹，各地均有大量种植，生产中为了提高结籽率，需要大量疏花。牡丹花中含丰富的营养物质，包括多酚类物质、蛋白质、可溶性碳水化合物、维生素、多种矿物质等[4]，以及类黄酮类物质，具有良好的抗氧化作用。

目前已有关于乳酸菌发酵对植物酚类物质和抗氧化性影响的报道，如：Cagno等[5]研究发现，混合果蔬汁发酵后，能防止果蔬汁酚类物质的降解，维持了其抗氧化活性；Tabasco等[6]发现，葡萄籽经乳酸菌发酵可增加其没食子酸的含量；郑欣等[7]研究发现，肠膜状明串珠菌相比其他菌发酵后，总酚和色差保留率高。但这些研究都未对发酵后单体酚类物质的变化进行研究。马利华等[8]研究发现，乳酸菌发酵槐花后，其营养性和抗氧化能力均有所提高；Park等[9]研究发现，植物乳杆菌发酵旋覆花花瓣后，总黄酮含量得到了提高。但这些研究都集中在单种菌发酵后物质的变化。韩雪等[10]发现，植物乳杆菌发酵红枣浆后，游离态酚含量和抗氧化能力优于其他菌种；Liu等[11]研究也表明，乳酸菌发酵诺丽果汁，可以增强其抗氧化能力。但都未研究发酵后抗氧化与色差间的联系。目前关于不同乳酸菌发酵对凤丹花瓣酚类物质、色差和抗氧化能力影响的研究鲜有报道。本试验拟以凤丹花瓣为原料，选用8种乳酸菌发酵后，根据总酚、总黄酮含量、色差值和抗氧化能力的变化，筛选出最适的菌种，并采用高效液相色谱法对发酵后单体酚变化进行了分析，以期为研发出一种新型的凤丹花乳酸菌发酵饮料提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

凤丹白花瓣：洛阳洛宁；

柠檬酸：食品级，河南兴源化工产品有限公司；

β-环糊精：食品级，江苏锐阳生物科技有限公司；

果葡糖浆：上海根莱食品有限公司；

植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum，HZLp-005)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei，HZLc-017)、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus，HZLh-003)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus，HZLb-006)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus，HZSt-012)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus，HZLr-023)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus，HZLa-008)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei，HZLp-019)：实验室保藏；

芦丁、没食子酸、芍药苷、对香豆酸、根皮苷、木犀草素、槲皮素、山萘酚：标准品，上海源叶生物科技有限公司；

福林酚试剂：上海源叶生物科技有限公司；

VC：分析纯，江苏强盛功能化学股份有限公司；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基：上海蓝季生物有限公司；

MRS培养基：广东环凯微生物科技有限公司；

甲醇、乙腈：色谱纯，天津市德恩化学试剂有限公司；

无水乙醇：分析纯，天津市德恩化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

电热恒温水浴锅：HH-S4型，北京科伟永兴仪器有限公司；

超净工作台：SW-CJ-2D型，苏州净化设备有限公司；

pH计：PHS-25型，上海精密科学仪器有限公司；

立式压力蒸汽灭菌器：LDZX-50KB型，上海申安医疗器械厂；

生化培养箱：SPX-250型，北京市永光明医疗仪器公司；

离心机：TG16-W型，河南湘仪实验室仪器开发有限公司；

分光光度计：UV-2100型，尤尼柯(上海)仪器有限公司；

全自动色差计：SC-80C型，北京康光光学仪器有限公司；

高效液相色谱仪：1260型，美国Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化 分别将8种乳酸菌置于MRS液体培养基中复壮，37 ℃静置培养18 h。

1.2.2 凤丹白花瓣浸提液制备 凤丹花瓣清洗干净后，切碎(3～5 mm)，加入15倍质量的去离子水打浆，添加护色剂(0.03% 柠檬酸、0.02%β-环糊精)于浆液中，65 ℃水浴1 h。浸提结束后，加入6%果葡糖浆，取100 mL分装于250 mL三角瓶中，100 ℃灭菌15 min。

1.2.3 凤丹白花瓣浸提液发酵培养 灭菌后的凤丹白花瓣浸提液，冷却，置于无菌操作台上，分别取 3 mL 乳酸菌发酵剂(菌浓度：8.0～9.0 CFU/mL)，5 000 r/min离心 10 min，弃上清，加入3 mL 灭菌的生理盐水重悬乳酸菌，接入灭菌的凤丹花瓣浸提液中，37 ℃静置培养36 h。发酵液10 000 r/min离心10 min，取上清。

1.2.4 总黄酮含量的测定 亚硝酸钠—硝酸铝法[12]。

1.2.5 总酚含量的测定 福林酚试剂法[13]。

1.2.6 色差的测定 参考Rui等[14]的方法采用全自动色差计(透射模式)对发酵凤丹花浸提液样品的色泽进行测定。

1.2.7 单体酚含量的测定 参考陈智毅等[15]方法，采用高效液相色谱仪。色谱柱：ZORBAX SB-C18(250 mm×4 mm，5 μm)；流动相A：水，流动相 B：乙腈；洗脱顺序：0～25 min，30%～60% B，25～30 min，30% B。柱温30 ℃；检测波长230，280，360 nm；流速0.8 mL/min，进样量10 μL。制作不同浓度的单体酚标准曲线，相关系数均达到0.999以上；标准品回收率为 94%以上，测定重复3次。根据保留时间及峰面积计算样品中单体酚含量。

1.2.8 凤丹花乳酸发酵液体外抗氧化活性测定

(1) DPPH自由基清除率的测定：参照文献[16]；

(2) ABTS自由基清除率的测定：参照文献[17]；

(3) 还原力的测定：参照文献[18]。

2 结果与分析

2.1 对总酚和总黄酮的影响

由表1可以看出，与发酵前相比，5种乳酸菌发酵凤丹花浸提液后，其总酚含量得到了提高，增加幅度为0.20%～4.95%，其中植物乳杆菌发酵后总酚含量显著增加(P<0.05)，增加量为4.95%。总酚含量增加排序为：植物乳杆菌>嗜酸乳杆菌>保加利亚乳杆菌>干酪乳杆菌>嗜热链球菌。通过8种乳酸菌发酵，发现不同乳酸菌发酵释放酚的能力不同。李俶等[19]研究发现酚类含量的提高可能是乳酸菌发酵过程中产生了某些酶类，对植物细胞壁进行了水解，进而使细胞中的一些酚类物质释放出来。植物乳杆菌相比其他菌，发酵后总酚含量显著提高，可能是其在发酵过程中使更多的糖基化酚类去糖基化，从而使植物细胞壁中可溶性酚释放[20]。Wouters 等[21]通过复合乳酸菌发酵韭菜，也发现了其游离酚得到了提高。Wu等[22]通过3种不同乳酸菌发酵石莲花后，发现游离酚含量得到了不同程度的提高，以植物乳杆菌发酵后游离酚含量提高最多。这些与本研究结果一致。

与发酵前相比，6种乳酸菌发酵后总黄酮含量得到了提高，增加幅度为0.64%～12.51%，其中保加利亚乳杆菌和植物乳酸菌发酵后总黄酮含量显著增加(P<0.05)。植物乳酸菌发酵后黄酮含量提高了12.51%，保加利亚乳杆菌发酵后黄酮含量提高了7.69%。总黄酮增加量按大小排列为：植物乳杆菌>保加利亚乳杆菌>鼠李糖乳杆菌>瑞士乳杆菌>干酪乳杆菌>嗜酸乳杆菌。黄酮含量的提高明显比总酚含量的显著，可能是复杂的多酚在发酵过程中被一些酶分解，变成了更简单的黄酮醇类化合物等[23]。其中植物乳杆菌发酵后，总酚含量和总黄酮含量都显著提高(P<0.05)。

† 同列不同字母表示差异显著(P<0.05)。

2.2 对单体酚的影响

单体酚标准曲线方程见表2。由表3可以看出，凤丹中芦丁和槲皮素是含量较多的2种单体酚；而木犀草素、对香豆酸、芍药苷、根皮苷和山奈酚的含量较低。乳酸菌发酵凤丹花浸提液后，大部分单体酚含量都有所降低，不同乳酸菌发酵凤丹花浸提液后单体酚变化也不同。仅保加利亚乳杆菌发酵后芦丁、槲皮素得到了显著提高(P<0.05)，其中芦丁提高了3.16%，槲皮素提高了0.81%。其他7种乳酸菌，植物乳酸菌发酵后芦丁含量下降最少，为4.84%；嗜酸乳杆菌发酵后槲皮素含量下降最少，为5.47%。

在除了保加利亚乳杆菌外，其他7种乳酸菌发酵后，芍药苷含量显著降低(P<0.05)，下降幅度为7.42%～83.20%。对香豆酸在发酵后含量都显著降低(P<0.05)，下降幅度为9.41%～44.10%。木犀草素的含量，仅瑞士乳杆菌发酵后含量增加，但不显著，其他下降幅度为4.29%～8.50%。而根皮苷经发酵后含量变化较大，嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌和瑞士乳杆菌发酵后均未检测到，植物乳杆菌发酵后含量显著提高(P<0.01)，增加了78.37%。山奈酚在发酵前未检测到，经保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌和嗜酸乳杆菌发酵后都有检测到，其中保加利亚乳杆菌发酵后含量最多。

以上结果表明，乳酸菌发酵对凤丹花浸提液中的单体酚含量和组成都有影响。其中保加利亚乳杆菌发酵后，芦丁、槲皮素、芍药苷和山奈酚含量都有一定的提高；植物乳杆菌发酵后，根皮苷、山奈酚含量提高。Kwaw等[24]用乳酸菌发酵桑葚汁后，芦丁、槲皮素含量显著增加。Bisakowski等[25]用植物乳杆菌对红洋葱发酵后，能使槲皮素二糖苷降解成槲皮单糖苷。Dueas等[26]研究表明，植物乳杆菌发酵豇豆后，游离态槲皮素含量增加，与本研究相似。研究[27]表明，乳酸菌发酵过程中，产生的多酚氧化酶对高分子量复合酚进行了解聚。pH的降低可以稳定一些酚类[28]，因此在较低pH浸提液中总酚含量高。在较低的pH范围内，酚类物质的提取量增加[29]。保加利亚乳杆菌产酸能力较弱，发酵液pH值较高，稳定酚类能力较弱，因此发酵后总酚含量没有植物乳杆菌高，但其单体酚含量多。

表2 单体酚标准曲线方程

表3 不同乳酸菌发酵对凤丹花浸提液中单体酚的影响†

† 同列不同字母表示差异显著(P<0.05)；ND表示没有检测到。

2.3 对色泽的影响

如表4所示，8种乳酸菌发酵对浸提液的亮度影响显著(P<0.05)，L*值均降低。除植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌和干酪乳杆菌外，其他乳酸菌发酵b*值均降低；除鼠李糖乳杆菌外，其他乳酸菌发酵a*值均增加。付磊等[30]研究发现凤丹白中几乎不含花青素，故其浸提液颜色淡黄。发酵后浸提液L*值的降低最为显著的是植物乳杆菌(P<0.05)，而其发酵后总酚、总黄酮最高，说明之间存在关系。如表5所示，L*值与总酚、总黄酮含量显著负相关(P<0.05)。Lago-Vanzela等[31]研究发现a*值与总酚和总黄酮含量有关，证实了表5中a*值与总酚极显著相关关系(R2=0.806 5)。b*值与总黄酮含量显著正相关(R2=0.761 4)，与总酚含量也正相关(R2=0.717 8)，表明总酚、总黄酮含量与b*值也有一定关系。研究[32]表明，当总色差△E>2时，样品的色泽变化可以通过肉眼观测，即样品间的色泽发生了显著的变化。8种乳酸菌发酵，其中植物乳杆菌△E值变化显著(P<0.01)，且>2，表明植物乳杆菌发酵后，浸提液颜色变化较大。

表4 不同乳酸菌发酵对凤丹花浸提液色差的影响†

† 同列不同字母表示差异显著(P<0.05)。

表5 总酚、总黄酮与色差的相关系数表†

† “**”表示P<0.01，差异极显著；“*”表示P<0.05，差异显著。

2.4 对抗氧化活性的影响

由表6可以看出，凤丹花浸提液经干酪乳杆菌、植物乳杆菌和保加利亚乳杆菌发酵后，DPPH自由基清除率与发酵前相比显著提高(P<0.01)，增加幅度为4.53%～11.14%。瑞士乳杆菌发酵后清除率增加不显著，增加了1.25%。DPPH在溶液中可以形成一个稳定的含氮自由基，抗氧化剂等加入后，通过传递电子或质子而生成稳定的分子状态DPPH2，乳酸菌发酵可能会生成一些含有递质子能力的化合物，从而使清除率升高[33]。由表7可知，DPPH自由基清除率与总酚、总黄酮含量呈正相关关系(R2分别为0.992，0.797)。 与发酵前相比，干酪乳杆菌、植物乳杆菌和保加利亚乳杆菌发酵后，ABTS自由基清除率都得到了提高，增加幅度为2.47%～6.58%，仅植物乳杆菌发酵后清除率得到了显著提高(P<0.05)，为6.58%。ABTS自由基清除率与总酚、总黄酮含量也呈正相关关系(R2分别为0.831 4，0.836 9)。

植物乳杆菌发酵后，DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和还原力分别增加了11.14%，6.58%，16.19%；保加利亚乳杆菌发酵后，DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和还原力分别增加了4.53%，2.47%，6.07%。这些与2种菌发酵后总酚、总黄酮含量高是一致的。

酚类化合物抗氧化能力的不同可能是其芳香环上所带羟基数量的不同引起的，因此根据溶液中所含酚类化合物种类和含量的差异，抗氧化活性也可能不同[34]。这些也都证实了，DPPH、ABTS自由基清除能力和还原力与总酚、总黄酮之间的高相关性关系。从单体酚含量分析，仅保加利亚乳杆菌发酵后，芦丁和槲皮素含量增加，而植物乳杆菌发酵后下降量也是最少的，这与2种菌发酵后高抗氧化能力存在一定联系。Bisakowski等[25]用植物乳杆菌对红洋葱发酵后，槲皮素二糖苷下降，而槲皮单糖苷增加，后者具有比前者更高的抗氧化活性。由此可见，乳酸菌发酵导致酚类物质间的相互转化，能明显改变其抗氧化性。

表6不同乳酸菌发酵前后的抗氧化性与VC的抗氧化性的比较†

Table 6 Comparison of anti-oxidation and anti-oxidation of VCbefore and after fermentation of different lactic acid bacteria

菌种DPPH/%ABTS/%还原力(OD值)发酵前80.23±0.45cd56.05±1.20bc0.247±0.04f干酪乳杆菌88.23±1.00a57.43±1.57b0.267±0.04c嗜热链球菌76.56±0.67e54.47±0.46de0.252±0.05ef保加利亚乳杆菌83.86±0.47b57.05±0.79b0.262±0.04cd植物乳杆菌89.16±0.47a59.71±0.66a0.287±0.03a鼠李糖乳杆菌79.76±0.61d55.43±0.65dce0.250±0.04f瑞士乳杆菌81.23±0.31c54.04±0.59e0.259±0.03de嗜酸乳杆菌79.33±1.08d55.95±1.43bcd0.278±0.05b副干酪乳杆菌77.40±0.46e51.62±0.57f0.233±0.05gVC54.06±0.40f43.10±0.35g0.206±0.04h

† 同列不同字母表示差异显著(P<0.05)。

表7抗氧化活性与总酚、总黄酮的相关系数表†

Table 7 The correlation coefficient of antioxidant activity and total phenol, total flavonoids difference

项目DPPHABTS还原力总酚总黄酮DPPH1.000 0 ABTS0.832 4∗∗1.000 0 还原力0.689 7∗0.823 3∗∗1.000 0 总酚0.992 0∗∗0.831 4∗∗0.887 6∗∗1.000 0 总黄酮0.797 0∗∗0.836 9∗∗0.724 3∗0.776 5∗∗1.000 0

† “**”表示P<0.01，差异极显著；“*”表示P<0.05，差异显著。

3 结论

本研究结果表明，8种乳酸菌发酵凤丹花瓣浸提液，部分乳酸菌能够增加其总酚、总黄酮含量，提高抗氧化能力。其中植物乳杆菌发酵后总酚和总黄酮的含量最高，与对照组相比分别提高了4.95%和12.51%(P<0.05)。芦丁和槲皮素是凤丹花瓣浸提液中主要的单体酚，保加利亚乳杆菌发酵后分别提高了3.16%和0.81%(P<0.05)。植物乳杆菌发酵后，DPPH自由基清除率增加了11.14%(P<0.01)，ABTS自由基清除率增加了6.58%(P<0.05)，还原力增加了16.19%(P<0.05)，其抗氧化能力是8种乳酸菌中最强的。植物乳杆菌发酵后，总色差△E>2，发酵液颜色较深，而保加利亚乳杆菌相对较好。因此，后期将采用植物乳杆菌和保加利亚乳杆菌来发酵凤丹花瓣。2种乳酸菌均能一定程度提高总酚、总黄酮含量，保加利亚乳杆菌对单体酚的组成和含量影响大，而植物乳杆菌发酵后抗氧化能力最强，故这2种乳酸菌发酵凤丹花瓣可提升其生理功能。