王 华 陈德文 周德强 曹丕宇

(1. 江苏省食品先进制造装备技术重点实验室，江苏 无锡 214122；2. 江南大学机械工程学院，江苏 无锡 214122；3. 无损检测技术教育部重点实验室﹝南昌航空大学﹞，江西 南昌 330063；4. 国家日用小商品质量监督检验中心，浙江 义乌 322000 )

食品在生产或食用时不会对广大群众造成损害是食品安全的含义[1]。食品安全问题主要集中在化学性危害、生物毒素、微生物危害、食品搀假等多个方面。食品中存在金黄色葡萄球菌是世界性卫生问题，跟据美国疾病预防控制中心报告[2]，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒，居全美第2位。金黄色葡萄球菌是引起食源性疾病发生率较高的5种病原菌之一，每年由金黄色葡萄球菌引起的食源性疾病病例达24万例[3]。近年来，随着抗生素的大量使用，金黄色葡萄球菌耐药性越来越强，甚至出现了多重耐药菌株和超级耐药菌株，致病能力也日趋增强[4]。因此，检测金黄色葡萄球菌具有较大的实际意义。目前，检验金黄色葡萄球菌的方法有常规细菌培养法[5-6]、免疫学方法[7]、分子生物学法[8-9]、质谱分析[10]、生物传感器检测法[11]等。近几年生物磁弹性传感器的研究有较大的进展，相较于传统方法目前很多学者利用磁弹性传感器自身质量变化而产生的共振频移的特性，在磁弹性传感器表面进行生物或者化学材料修饰，在其表面形成一层敏感薄膜，用以检测各类细菌和各种有机物[12-14]。但现阶段没有学者利用质量负载和传感器所处溶液黏度的变化来实现对相同物质的检测。

本试验拟利用磁弹性无线传感器对金黄色葡萄球菌的检测原理研究了黏度变化和质量负载变化对传感器的影响，并对比分析这2种方式的优缺点，利用磁弹性传感器的共振频移检测乳制品中是否含有金黄色葡萄球菌。

1 检测原理

对于非晶合金带材的磁弹性传感器而言，其基频共振频率f0可由式(1)计算：

(1)

式中：

L——非金合金带材的长度，mm；

E——非晶合金带材的杨氏模量，GPa；

ρ——非晶合金带材的密度，pg/mm3；

ν——非晶合金带材的泊松比。

磁弹性传感器在液体中的共振频率受到多个因素的影响，其中主要受2个因素影响，一个是非晶合金带材自身质量；另一个是传感器所处液体的黏度[15]。

当传感器自身质量发生变化时，根据式(2)可求得其变化后的共振频率。

(2)

式中：

A——传感器的面积，mm2；

d——传感器的厚度，mm；

m——传感器的重量，pg。

由于传感器厚度变化相较与质量变化所引起的频移较小，可以忽略不计，从而可得：

(3)

对上式采用二项式展开，并忽略高于二次以上的项，可以得到：

(4)

当磁弹性传感器被置入液体中时，由于液体黏度会产生一定的剪切力，会降低磁弹性传感器的共振频率。液体对磁弹性无线传感器的共振频率影响可以利用将磁弹性材料置入不可压缩液体内的振动理论模型进行分析计算。如图1所示，当磁弹性材料被置于液体中时，可以假定传感器的位置在2块面积很大且相等的平板之间，并且假设磁弹性材料位于YZ平面上，与上下固定平板之间的距离都为h。

磁弹性材料在黏性液体中的运动方程为：

(5)

图1 在液体中磁弹性材料的理论模型

式中：

ρ——膜片的密度，pg/mm3；

d——磁弹性传感器的厚度，mm；

η——液体黏度，mPa·s；

κ——与渗透深度相关的系数[κ=(1+j)/δ]，mm-1；

h——2个固定平板之间距离的1/2，mm。

通过求解式(5)可以得到：

(6)

式中：

式(6)左边是磁弹性传感器在液体中共振基频的平方项，右边第一项为式(1)的平方，即磁弹性传感器在空气中的共振频率的平方，等式右边的第二项则是液体中剪切力的消散作用对磁弹性传感器的影响。

当磁弹性传感器处在高黏度溶液中时，即2h/δ<<1的液体而言，磁弹性传感器的共振漂移可以表示为：

(7)

当磁弹性传感器处在低黏度溶液中时，即2h/δ>>1，磁弹性传感器的共振漂移则是：

(8)

2 试验部分

2.1 试剂与设备

2.1.1 试剂

氨基化适配体：生工生物工程(上海)股份有限公司；

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)：江南大学；

伊利鲜牛奶：市售；

丙烯酸：化学纯，国药集团化学试剂有限公司；

二乙酸荧光素(FDA)：97%，阿拉丁试剂(上海)有限公司；

胰蛋白胨、酵母粉：生物试剂，上海根生生物科技有限公司。

2.1.2 设备

数字显示旋转黏度计：NDJ-8S型，山东肥城佳贝尔仪器有限公司；

磁弹性传感器的基体是铁基非晶带材：尺寸为3 mm×8 mm×25 μm，上海黄浦区健磁电子；

信号发生器：ET3325型，杭州中创电子有限公司；

压力蒸汽灭菌器：XFS-280MF型手提式，浙江新丰医疗器械有限公司；

超净工作台：SW-CJ-2D型，苏州苏杰净化设备；

数据采集卡：DAQ2010型，凌华科技(中国)有限公司；

电热鼓风干燥箱：DHG-9015A型，上海一恒科学仪器有限公司；

荧光显微镜：Nikon 80i型正置，日本尼康株式会社；

自制TR型线圈：其中激励线为400匝，检测线圈为1 200匝，整个系统的结构框图如图2所示。

图2 TR型线圈示意图

2.2 试验方法

2.2.1 传感器的制备 采用的磁致伸缩传感器的材料为铁基非晶材料，将材料利用微切割技术剪裁成3 mm×8 mm的矩形薄片。先用乙醇将膜片清洗消毒后放入丙烯酸溶液中，密封1 h左右，待磁致伸缩膜片表面生成一层保护膜，防止磁致伸缩膜片生锈，为细菌提供一个生长场所，然后将膜片放置在超净台上通风，并用紫外线照射杀菌30 min，取浓度为1 μL/mL适配体溶液30 μL滴在传感器表面进行修饰，放在超净台上2 h使适配体固定在传感器表面。

2.2.2 测量 由于TR型线圈是基于离心管绕制而成的，先将牛奶加入离心管中，并将修饰好的磁弹性带材放入，然后使用扫频的方法，首先利用间隔为1 kHz的激励信号来确定共振点的大致频率范围，再在初次测取频率信号前后1 kHz的范围，进行间隔为100 Hz的小频率扫描，从而确定最终共振点的频率值。每隔1 h重复1次扫频，但在进行人工污染后的试验中，滴入金黄色葡萄球菌菌液30 min后增加了1组数据。由于数据采集可能存在误差，因此在每个频率点都采集5次数据，最终取5次的平均值作为每个频率点的最终阻抗值。

2.2.3 荧光试验 在频率检测试验结束之前，先将6孔板培养24 h。待测量试验结束时，先将浸入牛奶中的磁弹性生物传感器用0.9%的NaCl溶液冲洗，将磁弹性传感器从染菌的牛奶中取出并置于1个6孔板中，加入3 mL液体培养基和20 μL的FDA进行染色，37 ℃下继续培养15 min，在取FDA试剂时，将酒精灯点燃置于试剂瓶口15 cm内。之后采用荧光显微镜拍摄样品表面细菌荧光图。同时，准备一个在未染菌牛奶中静置的磁弹性传感器做对比。整个试验都需在超净工作台上进行。

2.2.4 黏度试验 利用黏度计自身的水平仪调节黏度计处于水平，估计牛奶的黏度范围选用合适的转子，在调节旋动黏度计升降架时，缓慢调节黏度计，当转子逐渐浸入样品中，直至转子上的标记与液面相平为止，使保护架、转子处于容器中心。待转子在样品中浸泡3 min，使转子温度与样品温度一致。开始测量。当转子在液体中旋转20圈以上再读取示数，每个试样至少测量2次。在第1次测量完毕后，按“复位”键，直至转子停止转动后，再次启动黏度计，开始第2次测量。测试结果取这2次测量结果的算术平均值。2次测量结果之差小于或等于2次测量结果平均值的10%，以保证测量的准确性，否则测量第3次。

3 结果与分析

3.1 修饰后的膜片在无金黄色葡萄球菌的牛奶磁弹性传感器检测试验

经过25 h的测量，得到了如图3所示的共振频率关于时间的图像。由图3可知将传感器放入牛奶中3 h内膜片的共振频率有很明显的上升。经过多次试验都出现了这种现象，这与前文中理论分析并不相符，针对这个现象，推测该现象是磁弹性传感器上的适配体没能充分固定，在振动过程中从磁弹性传感器上剥落，导致传感器的自身质量降低，使磁弹性无线传感器的共振频率上升。由于在这段时间内牛奶的黏度一直保持在1.60 mPa·s，没有出现变化，故排除因黏度变化造成的频移。从图3中可知，在经过12 h试验后，磁弹性传感器的共振频率发生了一些变化，由于此时试验过程中磁弹性传感器的位置发生了的变化，导致了磁弹性传感器的共振频率产生了一定的变化，当传感器位置稳定之后，频率稳定在76.9 kHz，在随后的几个小时并没有再次测取，因为已经证实3～11 h时在没有外在影响因素的情况下，传感器的共振频率会在一个稳定的频率值，因此在隔了9 h后再次测取其共振频率，测得仍为76.9 kHz。整个试验中，共振频率由原来的77 kHz变为了76.9 kHz，是因为磁弹性生物传感器在离心管中的位置发生了变化。

图3 磁弹性传感器在未染菌的牛奶中的频率响应曲线

Figure 3 Frequency response curve of magnetoelastic sensor in milk withoutStaphylococcusaureus

为了进一步证实该牛奶中是否含有金黄色葡萄球菌，利用荧光试验进行了验证，图4显示传感器上没有任何异样，证实了该牛奶是没有金黄色葡萄球菌。

3.2 修饰后的膜片在含有金黄色葡萄球菌的牛奶中磁弹性传感器检测试验

图5显示，在菌液滴入后的0.5 h内，传感器的共振频率有很明显的增大，该阶段主要是由于磁弹性传感器在离心管中位置发生了变化，在随后的3 h内，传感器的共振频率一直维持在77.2 kHz，而经过5 h后，传感器的共振频率再一次提高到了77.5 kHz，这是由牛奶黏度的变化所引起的，由于金黄色葡萄球菌的增殖分解了牛奶中的大分子物质，导致牛奶黏度减小，因此牛奶对传感器的消散作用减小，传感器共振频率增加，并在10 h时其共振频率达到最大值后，经过一段时间的培养，牛奶开始凝固，使得牛奶黏度上升，其对传感器的消散作用增大，传感器共振频率减小。这一过程也与黏度试验中的结果相一致。牛奶的黏度由初始的1.60 mPa·s 减小到1.45 mPa·s，之后牛奶的黏度再次上升到1.59 mPa·s。对比图3、5，发现传感器对其自身质量的变化具有较快的响应。虽然图5显示传感器也能较好地反映黏度变化，但是牛奶中的金黄色葡萄球菌繁殖引起牛奶黏度变化的过程比较缓慢。

由于染色试验使金黄色葡萄球菌在荧光显微镜下呈现绿色，图6显示传感器上吸附了较少的细菌。假设传感器上仍旧吸附适配体，那么适配体上定会吸附大量的金黄色葡萄球菌。显然电镜观测结果与假设不相符，因此进一步证实了适配体从膜片上剥落的推测，这也是在初始的阶段牛奶黏度没有很明显的变化而共振频率有明显上升的原因。

图4 未染菌的牛奶中磁弹性传感器在染色试验后电镜图片

Figure 4 Electron microscopy image of magnetoelastic sensor in milk withoutStaphylococcusaureusafter dyeing test

图5 磁弹性传感器在含有金黄色葡萄球菌的牛奶中的频率响应曲线

Figure 5 Frequency response curve of magnetoelastic sensor in milk containingStaphylococcusaureus

图6 染菌的牛奶中磁弹性传感器在染色试验后电镜图片

Figure 6 Electromagnetic image of magnetic elastic sensor in milk withStaphylococcusaureusafter dyeing test

4 结论

本试验研究了磁弹性传感器共振频率的测量原理，并制备了检测金黄色葡萄球菌的磁致伸缩无线传感器，研究了有菌和无菌情况下磁弹性传感器共振频移。验证了磁弹性传感器共振频率受到其自身质量影响，同时也验证了，磁弹性传感器置于黏性液体中受到液体黏度的影响，但由于牛奶中金黄色葡萄球菌引起牛奶的黏度变化较为缓慢，相较于自身质量变化，黏度变化不是快速检测的最优方案。此外发现磁弹性传感器相对于线圈的位置变化也会引起共振频移。

本次试验验证了这种磁弹性传感器对检测牛奶是否含有金黄色葡萄球菌具有较高的可行性。但忽略了磁弹性尺寸的影响，同时，牛奶的温度也会对检测结果产生影响，这些将在接下来的研究中进行探讨。