姜金仲，杨鹏鸣，王自布，穆安德，王兴春

1. 贵州师范学院，贵州 贵阳 550018；2. 贵州元亨山茶叶籽生物科技有限公司，贵州 贵阳 550018；3. 河南科技学院园艺园林学院，河南 新乡 453003

茶叶籽油是以茶树（Camellia sinensis）的种子为原料生产的食用油，因其含多种生物活性成分而被誉为东方橄榄油。茶叶籽油生物发酵生产工艺[1]是近年来报道的一种茶叶籽油生产新工艺。该工艺的核心技术是“茶叶籽水浆发酵分层”[2]；“茶叶籽水浆发酵分层”是指茶叶籽水浆（用茶叶籽仁加水粉碎过滤后的滤液）在适当的条件下经微生物发酵可以分为上、中、下3层；上层为茶叶籽油脂体，取出用于生产茶叶籽毛油；中层为发酵液，用于生产茶皂素；底层为淀粉，用于生产茶叶籽淀粉；因此，茶叶籽油生物发酵生产工艺可以用茶叶籽同时生产3种产品，大大提高了茶叶籽资源的利用率[3]。同时，由于是以茶叶籽油脂体为原料生产茶叶籽油，最大程度避免了茶叶籽其他构成成分对茶叶籽毛油的污染，简化了茶叶籽毛油的精炼程序，从而提高了茶叶籽油中天然活性成分的含量，改善了茶叶籽油的营养品质。茶叶籽油生物发酵生产工艺还能使成品茶叶籽油产量比压榨工艺提高15%～25%以上。

既然发酵分层现象是由发酵引起的，发酵液中就必然存在发酵微生物。姜金仲等[4]首先从发酵液中分离出了茶叶籽酵母，并对该酵母的发酵作用特性进行了初步研究，结果表明，茶叶籽酵母数量在发酵5 h后开始减少，10 h时已基本消失；但此时茶叶籽水浆还在继续发酵，说明此后有其他微生物替代了茶叶籽酵母继续发挥作用；为了证明其他微生物的存在，本文对发酵 5 h后的茶叶籽水浆发酵液进行了微生物分离鉴定，以期为优化茶叶籽油发酵工艺提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

茶叶籽仁：由贵州元亨山茶叶籽生物科技有限公司提供，土炕烘干带内种皮茶叶籽仁；用于生产茶叶籽仁的茶树种子主要摘自湖北省随州市，品种为福鼎大白茶，茶叶籽仁含水率8.4%、含油率（索氏抽提法）26.2%。

主要试剂：石油醚（德州润昕实验仪器有限公司）、蛋白胨及琼脂（安琪酵母有限公司）、牛肉膏（德州润昕实验仪器有限公司）、酵母膏（广州市昕迪实验器材有限公司）、K2HPO4（佛山市顺德区魏玛化工有限公司）、NaOAc（北京迪马欧泰科技发展中心）。主要仪器：XSP-9CA光学显微镜（上海光学仪器一厂）、PHSJ-4A pH计（西安禾普生物科技有限公司）、GL124-1SCN电子天平（季尔国际贸易（上海）有限公司）、TG16-WS高速离心机（济南来宝医疗器械有限公司）、ET-7打浆机（湖北武汉宏旭机械设备责任有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 茶叶籽水浆发酵液的制备

称取茶叶籽仁 100 g，加无菌水 300 g于35℃条件下浸泡16 h，将浸泡好的茶叶籽清洗后加无菌水300 g进行两轮打浆、过滤得滤液（茶叶籽水浆），将滤液置于35℃恒温发酵[2]，约5 h后，滤液开始明显分为上、中、下3层，备用。

1.2.2 植物乳杆菌的分离纯化

在茶叶籽水浆发酵进行到5 h时，从发酵液中层的中间位置取样，在MRS固体培养基上进行划线培养[5]，培养温度 25℃；长出菌落后，挑选独立的菌落，用接种针挑取样本放在载玻片上，用甲苯胺蓝染液染色[6]，观察是否有是类似乳杆菌的细胞，如果有类似乳杆菌的细胞，则接种扩大繁殖该菌落，再进行鉴定繁殖，反复4次，得到1株类似乳杆菌的细胞纯种，编号为JJZ21。

1.2.3 JJZ21菌株的鉴定

按照鉴定手册[7]中的方法对JJZ21菌株进行形态学观察及鉴定。包括：菌落形态及细胞形态的观察；繁殖特性及假菌丝的观察等；显微镜60倍镜下观察拍照。

16 S rDNA及pheS序列测定、分析及系统发育树的构建[8]：16 S rDNA及pheS的序列测定、分析及系统发育树绘制由中国食品发酵工业研究院微生物检测中心完成；测序结果利用GenBank数据库进行BLAST同源序列检索，然后采用MEGA5.0软件进行同源性分析，1 000次相似度重复计算，构建以置信度为依据的系统发育树。

1.2.4 发酵液JJZ21数量动态测定

按照1.2.1的操作步骤，进行茶叶籽水浆发酵，取0～19 h（每小时1次）发酵液中层中间位置液体稀释10 000倍，取0.2 mL稀释液用涂布法进行MRS固体培养基接种，然后于25℃恒温培养36 h[9]，数出每个培养基上的菌落数，重复3次。

MRS固体培养基按照文献[10]方法配制，另外每1 000 mL培养基中添加100 µL放线菌酮溶液，121℃、20 min高压灭菌。放线菌酮溶液的配制：准确称取所需放线菌酮，用75%酒精配制成100 mg·mL-1的放线菌酮溶液，存放于 0～4℃冰箱中[11]。

1.2.5 茶叶籽水浆发酵液pH的测定

从发酵开始，每隔1 h取出发酵液50 mL，4 000 r·min-1离心 10 min，过滤，用 pH 计测定pH。

1.2.6 发酵液可溶性干物质含量的测定

取清洁干燥培养皿编号，称重，用移液管吸取1.2.5滤液3 mL放于培养皿中，置于60℃烘干至恒重，重复3次，由此测算出发酵液可溶性干物质含量。

1.2.7 可溶性蛋白质及可溶性糖测定方法

取适量1.2.5中过滤后的发酵液，加水稀释，每个时间段稀释倍数一致。取稀释液1 mL，放入试管中（重复 3次），加入 5 mL考马斯亮蓝溶液，充分混合，放置2 min后，测定吸光度（595 nm），按标准曲线计算蛋白质含量[12]。取稀释液1 mL，加蒽酮试剂 5 mL，显色后用分光光度计在 620 nm下测定可溶性糖的吸光度，按照标准曲线算出可溶性糖含量[13]，重复3次。

1.3 数据处理

试验数据用 Excel 2003处理，并采用SSPS 17.0进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 JJZ21菌株的鉴定

2.1.1 JJZ21菌株的菌落及个体形态

JJZ21菌株25℃培养48 h的菌落呈圆形，白色，凸起，表面光滑湿润，边缘整齐；菌体呈杆状（图1），大小 (0.5～0.7) μm×(0.8～1.7) μm，单个或成对排列，革兰氏阳性。

2.2.3 JJZ21菌株的16 S rDNA及pheS基因序列测定及分析

图1 JJZ21菌株的个体形态Fig. 1 Individual morphology of JJZ21

JJZ21菌株的16 S rDNA序列全长为1 417 bp，pheS基因序列全长为410 bp。利用BLAST进行序列同源检索，相似度达到98%以上的植物乳杆菌（Lactobacillus）近缘种有10种，其中与Lactobacillus plantarumssp. plantarum的相似度达到了100%。以16 S rDNA及pheS基因序列的同源性为基础，用MEGA5.0软件进行系统进化分析，结果得到了如图2和图3所示的系统发育树。由图2的系统发育学分析结果可以看出，该系统树中Lactobacillus plantarumssp. plantarumATCC 14917T（ACGZ01000098）是一个单独的外群种，JJZ21菌株与该种单独构成一个分支；二者序列的相似性最大，遗传距离最小；但可靠性只有66%，不足以给出结论；但由图3可以看出，JJZ21菌株仍然与Lactobacillus plantarumssp. Plantarum相似性最大，遗传距离最小，且可靠性达到了100%；综合两种分析结果，可以初步结论：JJZ21菌株与Lactobacillus plantarumssp. Plantarum的亲缘关系最近。

综合形态观察、16 S rDNA及pheS基因序列比对、以及系统发育树的构建与分析，中国食品发酵工业研究院微生物检测中心将JJZ21菌株鉴定为：Lactobacillus plantarumssp. Plantarum；结合我们的研究编号，JJZ21菌株定义为：Lactobacillus plantarumssp.plantarumJJZ21；为方便以后在茶叶籽水浆发酵工艺中使用，我们将 JJZ21菌株取名为茶叶籽乳杆菌（Lactobacillus plantarumssp.plantarumJJZ21）。该菌种已于2016年9月9日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为：CCTCC M 2016471。

2.2 茶叶籽乳杆菌在茶叶籽水浆发酵过程中的数量动态

为了确定茶叶籽乳杆菌（Lactobacillus plantarumssp.plantarumJJZ21）在茶叶籽水浆发酵中的作用，测定了茶叶籽水浆发酵过程中不同时段发酵液中茶叶籽乳杆菌的数量动态，检测结果如图4。

由图4可以看出，发酵5 h后，发酵液茶叶籽乳杆菌数量快速增长，到 13 h时，达到最大值（每毫升149.6万个）；发酵进行到13 h之后，菌体数量开始逐渐减小，发酵进行到22 h之后，菌体数量逐渐维持在一个稳定的水平上。

图2 以16 S rDNA序列为基础的植物乳杆菌系统发育树Fig. 2 The phylogenetic tree based on 16 S rDNA

图3 以pheS基因序列为基础的植物乳杆菌系统发育树Fig. 3 The phylogenetic tree based on pheS gene

茶叶籽水浆发酵分层出现在发酵 5 h左右[2]；而茶叶籽乳杆菌数量是在发酵5 h之后才开始大量繁殖的，可见茶叶籽乳杆菌对于茶叶籽水浆发酵分层现象发生的早期作用不大。虽然茶叶籽水浆发酵分层最早发生在 5 h左右，但此时的顶层非常软散，不能进行茶叶籽油生产操作，一般要等到发酵 16 h时才是最佳操作点[3]；而茶叶籽乳杆菌是在5 h之后才进行大量繁殖的，所以，发酵进行到5 h之后，起主要发酵作用的微生物是茶叶籽乳杆菌；因此，茶叶籽乳杆菌是在茶叶籽水浆发酵中后期起主要作用的微生物。

2.4 茶叶籽乳杆菌发酵过程中发酵液可溶性干物质含量的变化

可溶性干物质质量：单位体积发酵液过滤后，60℃烘干后剩余物的质量；用 60℃烘干是为了保证烘干后的可溶性干物质不变性，便于后续的生化分析。茶叶籽水浆发酵液可溶性干物质含量随发酵时间的变化趋势如图5，由图5可以看出，可溶性干物质含量的变化分为4个阶段。

0～3 h之间（茶叶籽酵母[4]为主阶段）：可溶性干物质的含量随时间的增加而增加，最高点比最低点（发酵零时）增加 37.5%；3～7 h之间（茶叶籽酵母为主阶段）：可溶性干物质含量随时间的增加快速降低，最低点（7 h）比最高点（3 h）降低了62.5%；7～16 h（茶叶籽乳杆菌为主阶段）之间：可溶性干物质含量呈现震荡缓慢走低趋势，终点与本阶段起始点相比降低了24.4%，与发酵初期最高点相比降低了71.7%；16 h以后可溶性干物质含量呈现震荡走平趋势，意味着可溶性物质含量不再降低，可溶性干物质的消耗基本结束。

2.5 茶叶籽乳杆菌发酵过程中发酵液生化成分及pH的变化

茶叶籽水浆发酵液可溶性蛋白质含量随时间的变化趋势分为两个阶段（图6）。0～4 h，（茶叶籽酵母为主阶段）可溶性蛋白质含量呈现震荡走高趋势，在发酵4 h时达到最高点，最高点（7.95 µg·mL-1）比起始点（7.33 µg·mL-1）提高 8.4%。可溶性蛋白含量取决于茶叶籽中可溶性蛋白溶解于发酵液中的量，溶解得越多，发酵液可溶性蛋白的含量就越高。在一定范围之内，可溶性蛋白质在水中的溶解量会随水温提高而增加。茶叶籽水浆发酵液开始的温度一般是在 20℃左右，随着发酵时间的延长，发酵液温度会逐渐接近设定的发酵温度（35℃）；随着发酵液温度的逐渐提高，可溶性蛋白的溶解量逐渐增加，导致发酵液可溶性蛋白的含量震荡走高，在发酵 4 h时达到最高点。4～19 h之间（茶叶籽乳杆菌为主阶段）：发酵液可溶性蛋白含量呈现震荡走低的趋势，16 h之后，已基本稳定，此时的质量浓度（2.87 µg·mL-1）比最高点（7.95 µg·mL-1）降低了 63.9%。

图4 不同发酵时段JJZ21菌体数量动态Fig. 4 The dynamic changes of JJZ21 number during fermentation

图5 可溶性干物质含量随时间的变化动态Fig. 5 The dynamic changes of soluble dry matter during fermentation

图6 发酵液生化成分及pH随时间的变化动态Fig. 6 The biochemical component and pH of fermented tea seed water milk during fermentation

茶叶籽水浆发酵液可溶性糖含量随时间的变化趋势分为震荡走高阶段和震荡下降阶段两个阶段（图6）。0～4 h为震荡走高阶段（茶叶籽酵母为主阶段），发酵液可溶性糖含量呈现震荡走高趋势，最高点（8.11 µg·mL-1）比最低点（7.62 µg·mL-1）增加了 6.4%，其原因与上述可溶性蛋白相似，主要是由于发酵液的温度升高及发酵液生化指标的改变会导致可溶性糖的溶解度增加。4～19 h为震荡下降阶段（茶叶籽乳杆菌为主阶段），发酵液可溶性糖含量迅速下降，最低点（19 h）比最高点（4 h）降低了60.5%。

随着发酵时间的延长，发酵液pH逐渐降低（图6），由开始的最高点（6.28）逐渐降低到最低点（3.39），降幅达 46.0%。其中在发酵到5～9 h时，pH在4.5左右，根据茶叶籽蛋白质等电点约为4.5的观点[14]，此时发酵液pH正好接近茶叶籽蛋白质的等电点，意味着此时发酵液中的蛋白质溶解性降低、失去与水的亲和性，为茶叶子水浆发酵分层提供了一个促成因素。

2.6 茶叶籽乳杆菌数量与发酵液其他组分动态之间的关系

茶叶籽水浆发酵分层过程是一个微生物活动的过程；随着发酵时间的延长，发酵液干物质含量、可溶性蛋白质含量、可溶性糖含量及pH均逐渐降低，而乳杆菌的数量先增加后减少（表1）；这些降低是否与茶叶籽乳杆菌的活动有关系，可以通过相关分析得出结论，分析结果如表2。由表2可以看出，上述4种指标均与茶叶籽乳酸菌数量呈现极显著的负相关（P＜0.01）；结合图4的情况可以看出，发酵5 h以后，茶叶籽乳杆菌的活动是导致这些指标降低的主要因素。

表1 发酵液各种组分及pH随发酵时间的变化Table 1 Changes of various components in fermented liquid and pH during fermentation

表2 乳杆菌数量与发酵液其他组分及pH之间的相关分析Table 2 Correlation analysis of the number of LPJJZ21 and other components and pH in fermented liquid

茶叶籽乳杆菌通过消耗发酵液中的可溶性糖及可溶性蛋白质等物质，向发酵液中分泌乳酸等酸性有机物，导致发酵液pH逐渐降低，为发酵液中的油脂体（蛋白质包裹的油脂颗粒）上浮创造了条件，进而导致茶叶籽水浆发酵分层现象发生。值得说明的是pH降低只是发酵分层现象发生的因素之一，仅仅靠pH的变化不能完成发酵分层作用。

茶叶籽中的可溶性蛋白及可溶性糖是茶叶籽毛油生产过程中美拉德反应的原料，美拉德反应的产物会导致毛油的红色值增加[20]。茶叶籽水浆发酵液中可溶性糖及可溶性蛋白质含量大幅度降低，导致发酵法茶叶籽毛油的红色值大幅度降低，这是发酵法茶叶籽毛油色泽较压榨法毛油较浅的重要原因之一。

3 讨论

3.1 关于茶叶籽乳杆菌

茶叶籽乳杆菌是植物乳杆菌（L.plantarumssp.plantarum）的一个菌株。植物乳杆菌由于其自身的益生特性及生物学特性，被广泛应用于酸奶、干酪、乳酸菌饮料、干肠发酵、发酵泡菜及发酵调味品等食品中。例如：Seunggyu L等[15]对分离自泡菜中的植物乳杆菌生产酸奶的研究表明，该酸奶具有较好的抑菌功效。Erkkilä S等[16]应用植物乳杆菌发酵干肠，得到了新风味的干肠制品。周光燕等[17]将植物乳杆菌接种到泡菜中进行发酵，结果表明植物乳杆菌可明显降低泡菜中亚硝酸盐的含量。郭翔等[18]对植物乳杆菌作为益生菌的生物安全性做了研究，结果表明，植物乳杆菌对人体是安全无害的。综上所述，植物乳杆菌是一个具有广泛食品生产用途，且无毒无害的发酵微生物，因此，利用茶叶籽乳杆菌发酵生产的茶叶籽油、茶皂素及茶叶籽淀粉对人体也是安全的。值得一提的是茶叶籽水浆中含有大量的茶皂素，茶皂素具有很强的抑菌作用[19]，但是，茶叶籽乳杆菌（JJZ21）却能在高浓度的茶皂素溶液里安全快速繁殖生长，并完成发酵作用，这是一个值得进一步研究的现象。

3.2 茶叶籽乳杆菌与茶叶籽酵母的协同作用

酵母能够在不同程度上促进植物乳杆菌的生长[21]，在茶叶籽水浆发酵过程中，茶叶籽乳杆菌与茶叶籽酵母（Meyerozyma caribbicaJJZ11）之间也存在类似的促进关系，双方协作完成了茶叶籽水浆的发酵作用。姜金仲认为[4]，发酵液中茶叶籽酵母细胞的数量5 h之前居最高位，5 h之后迅速下降，到10 h时基本为零。本文中茶叶籽乳杆菌从发酵5 h开始快速生长，正好接替了茶叶籽酵母数量的下降。由此可以看出，发酵初期（5 h以前），茶叶籽酵母的发酵作用为茶叶籽乳杆菌提供了适宜生长环境，茶叶籽乳杆菌才得以快速增长，从而体现了二者的协同作用。茶叶籽水浆发酵分层开始在5～7 h之间，但分层理想状态是在16 h[2]，结合茶叶籽酵母及茶叶籽乳杆菌的数量变化动态可以看出，只有两种微生物共同协作，才能有效完成发酵法茶叶籽油生产工艺的发酵分层。

4 结论

JJZ21菌株是从茶叶籽水浆发酵液中分离出的一种杆菌，通过分离提纯、形态观察、16 S rDNA及pheS基因测序与比对、以及系统发育树的构建与分析，确定JJZ21为L. plantarumssp.plantarum杆菌的一个菌株；并将该菌株命名为：茶叶籽乳杆菌（L. plantarumssp.plantarumJJZ21）；菌种保藏号为CCTCC M 2016471。在茶叶籽水浆发酵过程中，发酵液中JJZ21菌体的数量5 h之后逐渐快速增加，到13 h时达到最大值，之后又逐渐降低，直至 22 h之后，又逐渐趋于稳定。茶叶籽水浆发酵过程中，茶叶籽乳杆菌需要茶叶籽酵母预先为其提供适宜的生长环境才能够快速繁殖生长。

茶叶籽水浆发酵过程中，伴随着茶叶籽乳杆菌数量的增加，发酵液中的干物质含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量及pH均明显下降，呈现极显著（P＜0.01）的负相关。茶叶籽乳杆菌通过消耗发酵液中的可溶性糖及可溶性蛋白等物质，向发酵液中分泌乳酸等酸性有机物，导致发酵液pH逐渐降低，为发酵液中的油脂体上浮创造了条件，进而导致茶叶籽水浆发酵分层现象发生。发酵液可溶性糖及可溶性蛋白质含量的降低还能使发酵法茶叶籽毛油的色泽变淡。